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蝙蝠葛活性成分对人白血病K562细胞株抗肿瘤作用及机制的研究*杨万山 孙 抒 汪俊颖 全宗学(延边大学医学院病理学与法医学教研部,吉林 延吉 133000)摘要:目的:研究蝙蝠葛活性成分体外对人白血病K562细胞株的抑制增殖和诱导凋亡作用,并探讨其作用机制。方法:应用MTT法检测蝙蝠葛活性成分对体外培养的人白血病K562细胞株的抑制增殖作用的影响及细胞毒活性;通过倒置显微镜对细胞进行形态学观察;通过免疫细胞化学S-P法测定凋亡关键效应酶Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3的表达情况,深入探讨蝙蝠葛活性成分对人白血病K562细胞株诱导凋亡的机制;结果:(1)MTT比色法结果表明,蝙蝠葛活性成分对人白血病K562细胞株的增殖抑制作用呈剂量依赖性(P0.01);(2)倒置显微镜观察:蝙蝠葛活性成分20g/ml作用后早期细胞出现凋亡形态学变化:细胞膜鼓泡、凋亡小体形成等;作用晚期细胞发生膜破裂坏死;(3)免疫细胞化学结果表明:蝙蝠葛活性成分作用后加药组Caspase9、Caspase-8和Caspase-3表达增加,与对照组相比较均有显著差异(P0.01); 结论:1、蝙蝠葛活性成分对人白血病K562细胞株具有抑制增殖和诱导凋亡作用。2蝙蝠葛活性成分对K562细胞抑制增殖作用在20g/ml作用24h之前主要以诱导凋亡为主。3、蝙蝠葛活性成分诱导凋亡作用机制可能通过上调Caspase-9、spase-8和Caspase-3蛋白表达,经由细胞凋亡的死亡受体通路和线粒体通路完成凋亡的启动和执行。关键词:蝙蝠葛活性成分;人白血病K562细胞株; Caspase-9蛋白;Caspase-8蛋白;Caspase-3蛋白;细胞凋亡Studies on the Anti-tumor Action and the mechanism of active components of menispermum dauricum to leukecythemia K562 cellsYangWanshan Sun Shu WangJunying QuanZongxueAbstract:Objective: To investigate the effect of active components of menispermum dauricum on inhibiting proliferation and inducing apoptosis of leukecythemia K562 cells.Methods: The growth inhibition rates and cytotoxic effect of leukecythemia K562 cells were measured with MTT assay; Observing cells morphologic changes under inverted microscope. The Caspase-9、 Caspase-8 and Caspase-3 proteins were determined by immunohistochemical S-P staining technique. We explored the mechanism of inducing apoptosis on leukecythemia K562 cells from active components of menispermum dauricum . Results: (1)MTT assay showed active components of menispermum dauricum could significantly inhibit the growth of leukecythemia K562 cells . The effect of active components of menispermum dauricum was in a dose-dependent manner(P0.01);(2)Under inverted microscope the leukecythemia K562 cells showed the classical apoptosis changes as the cell membrane blurred and apoptotic bodies appeared by treated with 20g/ml of active components of menispermum dauricum before 24 hours; after 24 hours cells showed necrosis;(3)Immunocytochemistry showed that the expression of Caspases-9、Caspases-8 and Caspases-3 proteins increased after the leukecythemia K562 cells treated by active components of menispermum dauricum, there were different significantly compared with control .Conclusions: (1) Active components of menispermum dauricum have the effect of inhibiting proliferation and inducing apoptosis for leukecythemia K562 cells ;(2) Before treated with the 20g/ml active components of menispermum dauricum for24 hours, the effect of inhibitive proliferation mainly was completed by the induction of apoptosis; (3)The mechanism of * 基金项目国家自然科学基金资助项目(No: 30960121),延边大学科技发展计划项目延大科合字( 2011)第52号,inducing apoptosis of leukecythemia K562 cells induced by active components of menispermum dauricum may be related with up-regulation expression of Caspase-9、Caspase-8 and Caspase-3.It might be induce apoptosis in leukecythemia K562 cells by the Fas-dependent pathway and mitochondria pathway. They have significantly anti-tumor effect and may be a new kind of antitumor drug.Key words: active components of menispermum dauricum;leukecythemia K562 cells; Caspase-9 protein; Caspase-3 protein; Caspase-8 protein ;Apoptosis; 肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下,局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常凋控,导致克隆性异常增生而形成的新生物1;肿瘤往往出现扩散与转移,对恶性肿瘤迫切需要全身性的有效治疗方法2。因此抗肿瘤药物的研发与应用已成为生物医学科学的一个迅速发展的重要领域。本实验以人白血病K562胞株为受试细胞,初步探讨了蝙蝠葛活性成分对K562细胞株的抑制增殖及诱导凋亡作用机制,对蝙蝠葛的抗肿瘤作用进行研究。1材料与方法1.1材料(1)Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3蛋白单克隆抗体(2)蝙蝠葛活性成分:由延边大学天然药物研究所提供。(3)人白血病K562细胞株1.2方法(1)体外细胞培养:人白血病K562细胞以适量浓度接种于100ml培养瓶中,加入RPMI-1640培养液置于37,5CO2浓度及饱和湿度恒温细胞培养箱中培养。待细胞生长至80或接近完全融合成片时,按所需浓度接种于培养瓶或实验用孔板中。(2)蝙蝠葛活性成分实验分组及配制:药物分组:蝙蝠葛活性成分分别配置终浓度为20g/ml、40g/ml、80g/ml、160g/ml。(3) MTT 法体外细胞毒活性测定:肿瘤细胞增殖抑制率()加药孔A值/对照孔A值100;在MTT实验基础上选定蝙蝠葛活性成分最适浓度进行以后实验。(4)细胞形态学观察:倒置显微镜活细胞形态学观察:(5) 免疫细胞化学染色1.3统计学处理2 结 果2.1 MTT法检测蝙蝠葛活性成分对K562细胞株的抗增殖作用表 1 蝙蝠葛活性成分对人白血病K562细胞增殖抑制作用(,n=3) 剂量(g/ml) 细胞生长抑制率() 24h 20 53.251.38 40 82.810.76 80 98.320.75 160 98.821.05 2.2 K562人白血病细胞的形态学改变 倒置显微镜观察在倒置相差显微镜下观察对照组K562细胞形态为圆形,细胞体积大,核圆形或椭圆形,核浆比例大,胞浆内未见颗粒,常聚集生长;可见核分裂相与瘤巨细胞。20g/ml加药组24h:K562细胞分散,稀疏存在,瘤巨细胞少见;体积缩小,胞浆浓缩,核浆比例减小,细胞核膜消失,细胞核断裂呈小块或碎片状可见到凋亡细胞及凋亡小体形成。2.3凋亡关键效应酶与凋亡相关基因蛋白表达水平的检测表 2蝙蝠葛活性成分对Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3蛋白表达的影响(n=5)剂量 (g/ml) Caspase-9 Caspase-8 Caspase-3 0 12.251.71 14.322.12 14.571.9320 78.173.08 79.654.16 81.834.91与对照组比较P0.013 讨 论基于蝙蝠葛现有的研究基础上,为探索蝙蝠葛活性成分的抑肿瘤机制,我们采用人白血病K562细胞株作为本次实验的受试细胞,研究其体外抑制增殖和诱导凋亡作用,从而揭示其可能的抑肿瘤作用,以期为蝙蝠葛开发成抗肿瘤新药提供进一步的实验和理论依据。3.1 蝙蝠葛活性成分对人白血病K562细胞株的增殖抑制作用 蝙蝠葛活性成分对人白血病K562细胞株的细胞毒性作用本实验通过MTT比色法检测蝙蝠葛活性成分的不同浓度作用于K562细胞后,表现出不同程度的细胞生长抑制作用;同时实验证明蝙蝠葛活性成分对K562细胞的抑制作用呈现剂量依赖关系;在80g/ml浓度作用24h之后和160g/ml作用24h之后,K562细胞生长抑制率可以达到90以上,因此蝙蝠葛可以在较高浓度下使细胞受到极度刺激而造成病理性死亡。3.2 蝙蝠葛活性成分对人白血病K562细胞株的诱导凋亡作用 蝙蝠葛活性成分对人白血病K562细胞株诱导凋亡形态学变化运用倒置相差显微镜观察:蝙蝠葛活性成分作用K562细胞后可清楚看到凋亡细胞和凋亡小体。通过各时段的连续观察发现:蝙蝠葛活性成分诱导K562细胞发生凋亡形成凋亡小体可以通过如下两种方式:一种通过细胞出芽脱落形成;另一种是整个细胞仅仅发生固缩和胞质浓缩,成为单个致密结构,而形成凋亡小体3。3.3蝙蝠葛活性成分对人白血病K562细胞株细胞凋亡通路的调控作用本实验从蛋白水平上初步检测了蝙蝠葛活性成分处理前后K562细胞中Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3的表达情况。结果显示:在对照组中三者均呈弱表达或不表达,而活性成分处理组三者表达明显增强,并且三者高表达的同时凋亡指数也升高。提示三种Caspases蛋白的表达改变与本实验中蝙蝠葛活性成分诱导K562细胞发生凋亡有密切关系;三者参与K562细胞的凋亡调控;推测蝙蝠葛活性成分可能通过与细胞膜表面死亡受体结合,然后激活细胞内Caspases级联反应由外源性凋亡通路完成对K562细胞的凋亡诱导作用。4 结 论1、蝙蝠葛活性成分对人白血病K562细胞株具有抑制增殖和诱导凋亡作用。2蝙蝠葛活性成分诱导凋亡作用机制可能与上调Caspase-9、spase-8和Caspase-3蛋白表达,经由细胞凋亡的死亡受体通路和线粒体通路完成凋亡的启动和执行。参 考 文 献1 杨光华,王恩华. 病理学M,第五版,人民卫生出版社,2002,80-822 甄永苏,邵荣光,李
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