螺旋体教学大纲要求.doc

螺旋体一、教学大纲要求（1）掌握螺旋体的定义，熟悉螺旋体形态与结构、培养特性、抗原成分与抵抗力，了解螺旋体的分类。（2）掌握螺旋体感染（性传播疾病和自然疫源性疾病）的临床意义。 （3）掌握梅毒螺旋体感染的微生物学检验，熟悉钩端螺旋体和回归热螺旋体感染的微生物学检验。二、教材内容精要（一）分类螺旋体（Spirochete）是一类细长、柔软、弯曲呈螺旋状、运动活泼的原核细胞型微生物。介于细菌与原虫之间。细胞壁含有脂多糖和胞壁酸，二分裂方式繁殖，对抗生素敏感，细胞壁与细胞膜之间绕有弹性轴丝，借助于轴丝伸缩而运动，易被胆盐或胆汁溶解，分类学上归广义的细菌范围。螺旋体主要依据其螺旋数目、大小、间距和规则程度等分类。螺旋体科（Spirochaetaceae）下有8个属，引起人类疾病的有3个属（表19-1）。表19-1 螺旋体的分类及致病性螺旋体种类属 名 致病种类 所致疾病 传播方式或媒介 疏螺旋体属（Borrelia） 伯氏疏螺旋体 莱姆病 硬蜱回归热螺旋体 流行性回归热 体虱赫姆疏螺旋体 地方性回归热 软蜱奋森疏螺旋体 多种口腔感染 机会感染 短螺旋体属（Brachyspira） 脊螺旋体属（Crisitisipira） 细丝螺旋体属（Leptonspira） 钩端螺旋体属（Leptospira） 问号钩端螺旋体 钩端螺旋体病 皮肤黏膜 小蛇形螺旋体属（Serpulina） 螺旋体属（Spirochaeta） 密螺旋体属(Treponema) 苍白密螺旋体苍白亚种 梅毒 性传播 苍白密螺旋体极细亚种 雅司 皮肤损伤品他密螺旋体 品他病 皮肤损伤苍白密螺旋体地方亚种 地方性梅毒 黏膜损伤（二）生物学特性1.形态染色螺旋体菌体的大小为30m0.20.4m。革兰染色阴性，但着色比较困难。疏螺旋体常用姬姆萨染色（Giemsa）呈紫红色，用瑞特（Wright）染色呈棕红色。钩端螺旋体和密螺旋体Fantana镀银染色后，螺旋体增粗，呈棕褐色，易于观察。新鲜标本在暗视野显微镜下，见其运动呈移行、曲伸、翻转、滚动状，有诊断意义。电镜下，螺旋体有细胞壁和细胞膜，细胞质与细胞壁组成原生质圆柱体，内有多个纤细的胞质管，外包薄而富有弹性的外膜和外鞘，胞质膜与外膜之间有数量不等的轴丝，也称周浆鞭毛或内鞭毛,轴丝的伸缩致螺旋体运动。2.培养特性 可人工培养的螺旋体营养要求高，有的需要特殊的营养物质，生长缓慢，在固体培养基上可形成菌落。如钩端螺旋体、伯氏疏螺旋体。苍白密螺旋体尚不能人工培养。3.抗原结构 螺旋体抗原分为属、种和型特异性抗原，能刺激机体产生相应抗体，所产生的抗体可用血清学试验检测。4.抵抗力螺旋体的抵抗力不强，螺旋体对冷、热、干燥、化学消毒剂、对抗生素和砷剂等敏感。（三）临床意义 螺旋体常见于水、土壤、人的口腔、动物体内及腐败的有机物中。螺旋体病临床分期较明显，病期与疾病的诊断密切相关。1自然疫源性疾病 在自然界中有多种动物是螺旋体的储存宿主，以啮齿动物为主。通过直接接触、吸血昆虫媒介等途径传播，引起螺旋体病。钩体病是一种典型的人、畜共患性疾病及自然疫源性疾病。回归热是一种由节肢动物传播、周期性反复发作的急性传染病。引起该病的疏螺旋体有两种：回归热螺旋体，以虱为传播媒介，引起流行性回归热；赫姆疏螺旋体，以蜱为传播为媒介，引起地方性回归热。该病目前在我国已较少见。伯氏疏螺旋体是引起莱姆病的病原体。2性传播疾病 在自然情况下，苍白密螺旋体通过性接触传播，也可通过胎盘垂直传播和输血感染。（）获得性梅毒临床上分三期。感染三周左右，在外生殖器感染的局部形成丘疹硬结，进而变为无痛性溃疡，称硬下疳，为期梅毒（硬下疳期），其溃疡渗出液中有大量的苍白螺旋体苍白亚种，传染性极强。一般周硬下疳常自愈，局部查不到苍白螺旋体苍白亚种。硬下疳初期的患者，梅毒血清学反应大部分呈阴性，以后阳性率逐渐增高。硬下疳出现后周，病期年以内全身皮肤黏膜出现梅毒疹，伴有全身淋巴结肿大，并可累及骨、关节、眼和其他脏器，为期梅毒（梅毒疹期），在梅毒疹和肿大的淋巴结中有大量的苍白螺旋体苍白亚种，传染性强。患者的梅毒血清学反应几乎全部呈阳性。感染梅毒年以后，可长达1015年，病变可波及全身组织和器官。病灶内苍白螺旋体苍白亚种少，传染性也小，但对机体的损伤很大。为期梅毒（晚期梅毒），（2）先天性梅毒多发生于妊娠个月后，系母体苍白螺旋体苍白亚种通过胎盘进入胎儿体内大量繁殖，可导致流产、早产和死胎，或生出梅毒儿，呈现马鞍鼻、锯齿形牙、间质性角膜炎和先天性耳聋等特殊体征。地方性梅毒和雅司不是性传播疾病，但两者的临床症状与梅毒相似。（四）微生物检验苍白密螺旋体（1）标本采集 期梅毒患者采集硬下疳溃疡渗出液，期梅毒则取梅毒疹渗出液和肿大的淋巴结抽出液，用于直接镜检；对感染梅毒周的患者可采取血液检查其血清中有无苍白螺旋体苍白亚种的抗体和反应素。（2） 检验方法1）显微镜检查视野显微镜检查 菌体纤细，两端尖，折光性强，弹簧状螺旋，且排列规则，运动方式为沿身体长轴旋转，滚动、伸曲、前后移行等。对苍白螺旋体苍白亚种有诊断意义。涂片染色 作Fontana镀银染色或姬姆萨染色后光学显微镜检查；用荧光标记的苍白螺旋体苍白亚种抗体进行荧光染色，置荧光显微镜下观察有无相应的抗原存在。2）免疫学检测 反应素检测试验 用牛心肌的心脂质、胆固醇和卵磷脂混合物做抗原包被到载体颗粒上，检查患者血清中的反应素，属于这一类的试验的有性病研究实验室试验（venereal disease research laboratory, VDRL）、不加热血清反应素试验(unheated serum reagin test, USR)、快速血浆反应素试验(rapid plasma reagin, RPR)、甲苯胺红不加热血清试验（toluidine red unheated serum test, TRUST）等，是临床初筛常规试验。病灶出现后12周就可以测出反应素，期梅毒阳性率约为70%，期梅毒阳性率近100%；经药物治疗后可转阴，可用于观察疗效，判断是否复发及再感染。但雅司、回归热等螺旋体感染；病毒性肝炎、麻疹、风疹、水痘等病毒性感染；麻风、活动性肺结核、传染性单核细胞增多症等细菌感染；妊娠、老年人、自身免疫病和吸毒时均可出现假阳性结果，但血清反应的滴度低，持续时间一般较短。故分析结果时应结合病史和临床症状，需作密螺旋体试验加以确证。现临床上出现反应素试验阴性，而密螺旋体特异性抗原血清试验阳性的情况。密螺旋体特异性抗原血清试验 用苍白螺旋体苍白亚种Nichols株作为抗原，检测血清中苍白螺旋体苍白亚种特异性抗体，这类试验的特异性强，可用作梅毒确证试验，但不能用作疗效的评价和判断复发及再感染。a.荧光密螺旋体抗体吸收试验（fluorescent treponemal antibody-absorption, FTA-ABS） 患者血清先用非致病性苍白螺旋体苍白亚种Reiter株超声波裂解物吸收，除去血清中交叉抗体，提高试验的特异性。把吸收过的血清加在涂有苍白螺旋体苍白亚种Nichols株抗原的玻片上，再加荧光素标记的抗人免疫球蛋白染色，荧光显微镜下观察，有发荧光的密螺旋体即为阳性。敏感性和特异性高，是I、II期首先出现阳性反应的血清学试验。而且患者经治疗后，反应仍不转阴。b.酶联免疫吸附试验（ELISA） 由苍白螺旋体苍白亚种Nichols株，经超声波粉碎制成密螺旋体抗原，检测患者血清中苍白螺旋体苍白亚种的抗体，可用于各期梅毒诊断，具有敏感性和特异性高、价廉、操作简便、快速、易观察等特点。c.苍白螺旋体苍白亚种血凝试验（treponemal pallidum hemagglutination assay, TPHA） 是间接血凝试验，以绵羊红细胞为载体，将苍白螺旋体苍白亚种Nichols株，经超声波粉碎成抗原，致敏绵羊红细胞后，加入待检血清作间接血凝试验，抗体滴度1:80为阳性。本试验敏感性高、操作简便、快速、易观察，但特异性不及FIA-ABS。d.苍白螺旋体苍白亚种抗体吸收微量血凝试验（microhemagglutination assay for antibodies to treponemal pallidum, MHA-TP） 是一种间接血凝试验，以TPHA的方法致敏醛化的绵羊红细胞，待检血清先与苍白螺旋体苍白亚种Reiter株及其他吸收剂和稳定剂等混合吸收，加入微孔板，再加致敏红细胞，若血清中含有苍白螺旋体苍白亚种抗体则红细胞发生凝集；用未致敏的红细胞作对照，以排除非特异性凝集。e.苍白螺旋体苍白亚种明胶凝集试验（treponemal pallidum particle assay, TPPA）与TPHA试验原理、阳性结果判断、优缺点基本相同；只是致敏颗粒是明胶代替了红细胞。f.免疫印迹试验（immno-blotting test, IBT） 先将苍白螺旋体苍白亚种抗原用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，再将凝胶中的抗原转移至硝酸纤维膜上，加待检血清，再加酶标记的抗人免疫球蛋白，然后加底物显色。刚出生的婴儿疑为先天性梅毒者，做血清学试验时，要排除来自母体的抗体。但由于苍白螺旋体苍白亚种、雅司螺旋体等抗原相似，密螺旋体抗原血清学试验不能区别这些密螺旋体及其所致疾病，因此，在结果判断时应结合病史和临床症状来分析。2钩端螺旋体（1）标本采集患者发病1周内采取血液；1周以后取尿液；有脑膜刺激症状则取脑脊液检出的阳性率高。感染610d可检出抗体，34周抗体达最高水平，尸体、动物应取肝、肾、脑和肺送检。也可采集钩端螺旋体污染的水、土壤等作标本。（2）检验方法1）显微镜检查暗视野显微镜检查 直接观察辨别标本中钩端螺旋体的形态和运动。用于早期诊断，方法简单、快速，但检出率低。将急性期患者的抗凝血先以1000 r/min低速离心510min，取上层血浆再以4000 r/min高速离心1h，用沉淀物制片暗视野显微镜镜检。涂片染色 一般用Fontana 镀银染色，呈棕褐色。也可用直接免疫荧光抗体染色和免疫酶染色检查。2）分离培养 血培养 取钩端螺旋体血症期的患者血液12ml，分别接种于5ml柯氏培养基3管进行培养，若患者已用青霉素治疗，可事先在培养基中加入1500U/ml的青霉素酶。尿培养 发病2周后取中段尿，4000r/min 离心1h，取沉淀物接种24管加有5-氟尿嘧啶250g/ml或新霉素525g/ml的Korthof培养基，这样可避免污染菌的影响。酸性尿者应在取尿前1d晚上服小苏打24g 使尿呈中性或弱碱性。其他标本 脑脊液取0.5ml培养；动物肝、肾组织块，污染的水和土壤等，均可进行分离培养钩端螺旋体。上述培养物28孵育24周，每隔35d用暗视野显微镜观察一次，大部分阳性标本在714d有生长表现，由于钩端螺旋体是需氧生长，离培养基液面1cm内的部位钩端螺旋体最多，故培养基显现出云雾状混浊。用暗视野显微镜检查有无钩端螺旋体，若有，用显微镜凝集试验（microscopic agglutination test, MAT）和凝集素吸收试验（aalutination absorption test，AAT）鉴定其血清群和血清型。连续观察40d，均无生长现象，才可判为阴性。3）动物试验 动物接种是分离钩端螺旋体的敏感方法，尤其适用有杂菌污染的标本。常用幼龄豚鼠和金地鼠。将标本注入动物腹腔，一般37d发病。第一周末取心血及腹腔液暗视野显微镜检查并作分离培养。动物死后解剖可见皮下和肺部有大小不等的出血灶，肝、脾组织显微镜下有大量钩端螺旋体存在。4）核酸检查 用特异性DNA探针杂交法或PCR技术，检测标本中钩端螺旋体的核酸。快速、敏感。若先用PCR技术扩增标本中钩端螺旋体的核酸，再用特异性DNA探针杂交法，可提高敏感性，但要注意环境中DNA污染。5）免疫学检测 显微镜凝集试验或称凝集溶解试验 螺旋体与特异性抗体结合发生凝集现象，在暗视野显微镜下明显可见，若加入补体凝集的钩端螺旋体可发生溶解现象。本试验特异性和敏感性较高。血清中特异性抗体凝集效价1:300为阳性。间接凝集试验 将钩端螺旋体特异性抗原吸附在载体颗粒上，若待检血清有相应抗体存在，可出现凝集现象。此方法快速简便，但特异性不如MAT，可用于标本的筛选和基层实验室使用。常用载体颗粒有活性碳、胶乳、红细胞等。载体为活性碳的凝集效价1:8、载体为胶乳的凝集效价1:2可判为阳性。酶联免疫吸附试验 用ELISA法和斑点-ELISA检测患者血清中钩端螺旋体特异性抗体IgM，用于钩端螺旋体病的快速诊断。被检血清的OD值为阴性对照OD值2倍为阳性。也可肉眼直接观察结果。3伯氏疏螺旋体（）标本采集 采取病损皮肤组织、血液、淋巴结抽出液、关节滑膜液、尿液、脑脊液等。（2） 检验方法1）显微镜检查暗视野显微镜 可直接观察辨别标本中疏螺旋体的形态和运动。涂片染色 姬姆萨染色着色良好，呈紫红色，由于患者体内伯氏疏螺旋体数量少，故实验室诊断中价值不大，可作为蜱内脏组织和人工培养物的螺旋体的检出。2）分离培养 BSK（Barbour Stoenner Kelly）复合培养基是含有牛血清白蛋白和灭活兔血清等营养丰富的液体培养基。用BSK培养基增菌， 由于伯氏疏螺旋体生长缓慢，甚至需培养12周之久，其间可用暗视野显微镜检查，若12周一直是阴性，盲传一次。3）免疫学检测 间接免疫荧光法 在有伯氏疏螺旋体抗原片上，滴加不