医学博士科研计划书.doc

LncRNA-ANCR基因表达对大鼠退行性脊柱侧凸影响的实验研究退行性脊柱侧凸(degenerative scoliosis，DS)通常指机体骨骼成熟后出现的脊柱腰段的侧凸，冠状面Cobb?角大于10，同时可以存在矢状面失衡和/或脊椎的旋转异常。随着全球人口老龄化及老年人生活方式转变，DS已成为导致脊柱畸形、影响生活质量的一种腰椎退行性疾病。由于DS的具体病因还未明确解释，当前关于DS的研究绝大多数是针对治疗，涉及病因学方面的基础研究很少。因此，进一步研究DS的病因及发病机制具有非常重要的意义。长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。研究表明，LncRNA在调控表观遗传、细胞周期和细胞分化等细胞分化和个体发育的生命活动中发挥重要作用，并与人类疾病的发生密切相关，其中包括癌症、退行性疾病在内的多种严重危害人类健康的重大疾病，成为当前研究热点。其中，ANCR（anti-differentiation ncRNA，抗分化ncRNA）为一个855 bp lncRNA，在细胞分化期间下调。ANCR在包含祖细胞群体中的减少，没有任何其他刺激，导致快速分化基因诱导。本研究正是选择LncRNA-ANCR这一基因，旨在通过研究该基因和大鼠DS之间作用关系，为进一步从分子生物学水平研究DS的发病机理，希望从发病的初始关键环节上预防该类型疾病发生。参考文献（1）Dalle-Carbonare L，Innamorati G，Valanti MTTranscription factor Runx2 and its application to bone tissue engineeringJStem Cell Rev，2012，8(3)：891897.（2）Liu TM，IR EH Transcriptional regulatory cascades in Runx2 dependent bone developmentJTissue Eng Part B Rev，2013，19(3)：254263.（3）Lin Zhu，Pei-Cheng Xu，Downregulated LncRNA-ANCR promotes osteoblast differentiation by targeting EZH2 and regulating Runx2 expressionJ，Biochemical and Biophysical Research Communications 432 (2013) 612617.（4）Glass DA. Canonical Wnt signaling in differentiated osteoblasts controls osteoclast differentiationJDev Cell，2010，104(9)：1670216707.（5）刘锡梅，马越鸣，丁伯平等，大鼠两种骨质疏松模型的建立J.皖南医学院学报，2001,20(1)：4-5.（6）刘晓阳，邱贵兴，翁习生等，长链非编码RNA在青少年特发性脊柱侧凸中的表达研究J.中国骨与关节外科，2014,3（7）:235-240.（7）Daffner SD，Vaccaro AR. Adult degene rative lumbarscoliosis.Am J Orthop, 2003,32(2):77-82.（8）Kretz M , Webster DE , Flockhart RJ?etc, Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCRJ, Genes Dev.2012，26 (4) ：338343.（9）李慧章，叶君健。骨形态发生蛋白在椎间盘退变中的研究J. 福建医科大学学报，2005,39（1）：53-55.（10）Cui M;Wan Y;Anderson DG. Mouse growth and differentiation factor-5 protein and DNA therapy potentiates intervertebral disc cell aggregation and chondrogenic gene expressionJ. Spine Journal，2008，8（2）:287-295.创新点：LncRNA是当前的研究热点，在癌症方面研究相对较多，本研究借此热点探讨LncRNA-ANCR在大鼠DS发生发展过程中的作用。若探明LncRNA-ANCR和DS之间的作用关系，从而人为地调控LncRNA-ANCR的作用机制，从早期防治DS，为防治DS开辟一个新思路。实验设计与技术路线：1重组LncRNA-ANCR腺病毒表达载体的构建、鉴定（1）根据LncRNA-ANCR前体序列应用Primer premier 5 软件设计引物。（2）利用PCR技术扩增出LncRNA-ANCR前体的DNA序列。（3）LncRNA-ANCR前体的DNA序列重组入腺病毒miRNA表达载体。（4）应用Lipofeetamine 2000将重组LncRNA-ANCR腺病毒表达载体与辅助包装质粒共转染如293T细胞进行病毒包装。（5）收集、浓缩、纯化和滴定重组LncRNA-ANCR腺病毒。2. 重组LncRNA-ANCR腺病毒表达载体转染大鼠BMSCs的细胞学研究（1）大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离、培养选取2月龄大鼠，无菌条件下获取自体骨髓，用Ficoll淋巴细胞分离液梯度离心法进行分离、培养，获得自体原代骨髓干细胞，传代培养。应用CD45、CD34、CD29、CD105单克隆抗体，FACS（流式细胞仪）检测BMSCs表面抗原表达。细胞分组：基因组：LncRNA-ANCR载体转染的BMSCs无关序列组：无关序列载体转染的BMSCs空载体组：空载体的BMSCs空白对照组：无特殊处理的BMSCs（3）检测BMSCs分化指标TaqMan RT-PCR和Western-blot方法分别检测各组BMSCs内BMP7 mRNA、Runx2 mRNA和GDF5 mRNA 以及相应蛋白表达3. 重组LncRNA-ANCR腺病毒表达载体对大鼠DS的动物实验研究（1）实验动物：刚断乳的SD大鼠50只，分5组，每组10只。（2）实验分组：空白对照组：无特殊处理模型组：仅双上肢截肢空载体组：双上肢截肢+注射空载体转染的BMSCs无关序列组：双上肢截肢+注射无关序列载体转染的BMSCs基因组：双上肢截肢+注射LncRNA-ANCR载体转染的BMSCs（3）影像学观察测量大鼠脊柱形态变化（4）病理学：观察椎体和椎间盘病理变化（5）基因表达：TaqMan RT-PCR检测BMP7 mRNA、Runx2 mRNA和GDF5 mRNA表达（6）蛋白表达：Westernblot检测BMP7、Runx2和GDF5蛋白表达预期目标和意义：成功构建和鉴定重组LncRNA-ANCR腺病毒载体。将重组LncRNA-ANCR腺病毒载体转染到BMSCs细胞中，阻断或