色谱文献综述.doc

第1章 文献综述1.1. 引言高效液相色谱（HPLC）作为分析化学中复杂体系分离分析的重要手段之一，在许多领域都有着广泛的应用。蛋白质组学1-4、中药1-3、聚合物4-6、环境7和药物8等复杂体系的分离分析为各种色谱技术的发展带来了机遇和挑战。蛋白质组学和中药等研究中样品体系极其复杂，采用传统的一维分离模式所能提供的分辨率和峰容量难以满足高效分离与高灵敏检测的要求9, 10。Gidding等11指出，当样品中的组份数超过系统峰容量的时，样品在系统中便得不到良好的分离。对于随机分布的样品，完全分离其中98%的组份，系统的峰容量需要是样品中组份数的100倍以上12，采用一维液相色谱进行分离时，分离500个峰需200万理论塔板/m（分离度1.5）的柱效13。显然，我们不能寄希望于一维色谱分离能力能提高几个数量级14，因此，只能采取其他方法，如多维色谱分离系统。多维色谱技术的历史可以追溯到1944年，Martin和同事利用纸色谱法15，在两次分析中，将流动相以直角的方式洗脱样品，第一次实现了二维的高效分离。近年来，色谱工作者把主要的精力放在使用现代柱色谱技术代替薄层技术上。柱色谱技术的优点包括重现性、速度、选择性和易用性，重要的是，柱色谱易于与其他检测技术相连，如质谱。1978年，Erni和Frei16设计出了阀切换系统，构建了GPC/RPLC模式的二维色谱。由于采样不足（切阀时间长达75 min），分离度有限，同时没有自动化的阀配置和数据转换过程，没有给出二维色谱图，因此并没有引起重视。1987年，J. W. Jorgenson受J. C. Giddings的启发，开始研究复杂样品分析实用的多维色谱方法。1990年17， Bushey和Jorgenson改进了Erni和Frei的装置，构建了IEX/SEC二维系统，通过降低采样时间到6 min，以及协调两维间的流动相梯度和流量，实现了较高的正交性分离，并第一次以3D图的方式展现出来，实现了蛋白质的全二维分析，第一次展现了多维色谱的巨大优势。为了与传统的“中心切割”方法相区别，Jorgenson将他命名为“全二维（comprehensive）”，以表示该方法包括了样品的全部信息18。全二维的另外一个进展是与质谱检测联用。Opiteck等在所构建的IEX/RP19和SEC/RP20系统中，首次将电喷雾质谱和UV与二维系统在线联用进行蛋白质和多肽鉴定。将NP与RP联用被认为是正交性最好的系统，但由于流动相兼容性不好，一直难以实现。Murphy等4首次将正相与反相联用，通过使用水为正相流动相，避开了流动相兼容的难题。Dugo等21第一次实现真正意义上的NP/RP分离，通过第一维使用二醇基微柱并且在低流速下运行（20 L/min），而第二维使用C18整体柱在高流速下运行（4 mL/min），十通阀连接两个定量环，每分钟切割一次，实现了柠檬油的正交性分离。Francois等22改进了系统，添加了二维泵、色谱柱和检测器，更重要的是添加了一个十通阀23，使得第二维以平行柱模式运行，分析时间2 min，大大降低了第一维流动相对第二维分离的干扰，实现了更高的峰容量。另外一种构建NP/RP二维系统的装置是在接口处将不兼容溶剂蒸发去除。关亚风课题组3, 24, 25使用了真空辅助溶剂挥发接口去除馏分中的溶剂；Francois26使用超临界流通色谱（SFC），流动相为超临界的二氧化碳，降低压力后直接挥发去除。Carr课题组提出了以高温色谱和高线性流速进行洗脱以加快第二维的分离速度7, 27, 28。以十通阀连接两个定量环，通过将第二维分离温度升高到110 C，第二维梯度洗脱时间仅21 s，二维分离总时间仅需20 min，而峰容量高达1350，相当于一个峰容量单元仅占1 s。全多维液相色谱技术蓬勃发展，2006年以后发表的综述类文献就有43篇6, 9, 10, 27, 29-68。多维色谱具有足够高的峰容量和高选择性为解决复杂体系分离问题提供了有效工具，并已在蛋白质组学研究、环境样品的分析、中药研究、生物医药16，17及烟草分析18等方面得到广泛应用。本章将从多维液相色谱理论、二维液相色谱系统、接口技术、联用方式及应用等方面对近年液相色谱的最新进展进行综述。1.2. 二维液相色谱的峰容量、正交性和采样频率特征早在1967年，Giddings69就提出了描述等度峰容量的公式。Giddings等指出，在各维色谱分离模式完全不相关的条件下，多维色谱的总分辨率等于各维分辨率平方和的平方根，总的峰容量等于各维峰容量的乘积。与一维色谱相比，多维色谱的分辨率和峰容量有了极大的提高。理论上，多维液相色谱系统可以组合的分离模式的数目即系统的维数并没有限制。但实际应用中受仪器成本、操作复杂性、检测池体积和检测器选择性等因素的制约，目前所报道的多维液相色谱基本上为二维液相色谱（2D-LC）。二维液相色谱(2D-LC)是将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统。样品经过第一维色谱柱分离后进入切换接口中，通过接口的富集、浓缩以及切割后进入第二维色谱柱继续分离。基于 Giddings70的理论，Schoenmakers71定义全多维液相色谱模式（Comprehensive Multidimensional LC）应满足3个条件：（1）样品的每一部分都受到不同模式的分离；（2）所有样品组份以相等的比例（100%或稍低一些，即并不要求100%分析物，只要分流的部分能代表所有样品组份信息即可）转移到二维及检测器中；（3）在一维中已得到的分辨率基本上维持不变。“基本”指通过测量全二维中第一维轴上的某个特殊峰所对应的第一维的分辩率与一维情况相比减少不超过10%。其中，第一条和第三条说明了传统的中心切割技术与全二维的区别。Schoenmakers 等认为在二维分离之前进行分流也可称为全二维分离，进一步拓宽了全二维分离的概念。1.2.1. 峰容量使用二维色谱技术的直接原因是增加峰容量。峰容量72是指在两次保留时间之间，按一定分离度所能放置的峰的个数。起初，峰容量用来描述分离系统中所能容纳色谱峰的个数，此时的峰是规则的，即峰的保留时间是倍数关系，因此，峰间距是常数。然而，峰容量由峰宽决定，而峰宽与塔板数和分离度有关，多数分离技术中实际分离的峰宽是随机的，因此，实际峰容量与理论不符。峰容量nc的概念是由Giddings69提出的，与塔板数与塔板效率相比，峰容量提供了对分离性能的更为通用的估计。等度分离时，Grushka73给出的峰容量公式为：11LC等度分离时的峰宽并不是恒定的，梯度洗脱条件下，可以认为峰宽是常数74。则峰宽可以表示为：12一维色谱中，恒定的峰宽具有更大的峰容量，二维色谱也是如此。一个简单直观的峰容量计算可以由保留时间除以峰宽得到，即：13这个公式在讨论实际样品峰容量75时较有效，因为它是根据色谱图上时间峰的数目计算的，而不受限于一维或多维技术。尽管如此，由于峰的随机分布，实际谱图上的色谱峰数目总是小于计算的数目。针对特定的应用，峰容量的确有许多报道。Wang等人76尝试了多肽分离的峰容量的优化与计算，而Wren77则针对超高效液相色谱（UPLC）中的梯度分离专门讨论了这个问题。Neue78最近综述了在等度LC、尺寸排阻（SEC）LC、多肽梯度分离等方面计算峰容量的不同方法。Guiochon14讨论了1D-LC分离中测定峰容量的局限性。计算峰容量的大量的理论和方程表明，尽管分析界认可峰容量计量学（peak capacitymetric）是该领域的迫切需求，然而选择一种可以在不同研究之间进行比较的合适的近似方法是很困难的。Guiochon等79-81详细计算了2D和3D峰容量，显示出了多维色谱巨大的峰容量优势，并指出这个优势可以解决峰重叠的问题。Giddings提出82多维色谱峰容量的计算可以由单维色谱峰容量的乘积估算：14由单个色谱峰容量乘积而得到的总峰容量，显示出了这种分离方式的巨大优势，这也在某种程度上促进了使用柱色谱技术代替薄层色谱，也直接导致了全二维色谱的诞生。实际二维峰容量通常低于（4）式所得的预测值，这取决于两维之间的相似度，因为该值包含一个两维间保留相关性的区间。在计算实际的2D-LC峰容量时，需要对一些相互影响的因素进行评估，包括正交性和采样频率。如果2DLC中使用的两个色谱柱在分离机理上有一定的相关性，则峰容量低于乘法所得到的数目。另外，如果第二维不能够完全采集第一维色谱流出的样品，则峰容量也没有完全利用7，由采样造成的峰容量局限近来由Tanaka83提出。峰容量的值并没有给出产生这些峰所花费的时间。色谱理论中，每单位时间所产生的峰容量常用来表示此项技术的效率，Grushka84在1984年实现了这方面的要求。Carr85在2DLC中使用梯度洗脱，在25min内产生了900的峰容量，即峰宽为2s。实际峰容量计算的不同策略严重阻碍了不同小组之间分析结果的比较，多维（MD）分离性能很容易有意或无意地高估，峰容量一般过高。因而，在将来的全二维液相色谱（comprehensive LC）领域，通过由专家们取得一致同意的基础上，提出一些约定或惯例，从而建立一种简单方法。另一方面，峰容量的概念在分析化学中是通用的49，例如，样品可以在时间维度上分离，即柱色谱，也可以在空间维度上，即薄层色谱。同样，质谱可以在空间维度上分离样品，如使用四极杆质量检测器，依照质荷比分离，也可以在时间维度上分离样品，如使用飞行时间质量检测器，样品到达检测器的时间与质荷比有关。因此，当考虑到检测器本身的维度时，分离的维度可以进一步增加。Russell86使用IM-MS检测器分离多肽时测得峰容量约2600，如果这种技术与2DLC正交，则联用可产生近一百万的峰容量。Merenbloom87将IM-MS以二维的方式连接，构建了2D-IMS系统，峰容量仅有480-1360，远远低于一维的容量。Frahm88考察了FT-ICR与质谱相连用于蛋白质组的研究。峰容量的概念可以用于所有质谱检测，如果质谱与色谱正交，则可以将MDLC与MS峰容量乘积，获得巨大的峰容量。Lewis89、Shen90和Valentine91等在LC-MS和2DLC-MS分析中提到了质谱的峰容量，但都没有严格测量。峰容量的概念也可以用于DAD，尽管这种多波长的紫外检测器可以通过化学计量学的手段将重叠峰分开，但所提供的峰容量不如MS多。即使只有2倍的峰容量，DAD检测器与化学计量学技术相连时仍具有一定的优势。1.2.2. 正交性在LCLC系统中，两维之间的正交性是非常重要的。通常，如果采用的两种分离机制是互相独立的并且具有完全不同的保留曲线，或者说具有不同的选择性，则认为该2D分离是正交的12, 92-94。正交性的概念和含义如图1(a和b)所示，并以NP-LCRP-LC（图1c）和RP-LCRP-LC（图1d）分别分离柠檬油和类固醇为实例作为说明。从图1a可观察到低相关性（高正交性），其中，样本随机地分布在整个分离空间，而图1b中则显示出高的线性相关性。在这种情况下，增加额外分离维数的结果是除增加了系统的复杂性外没有任何实际意义。从技术角度来说，真正意义上的正交很难实现，因为正交性不仅取决于分离机制，而且依赖于溶质的性质以及分离条件。实际上由于溶质的本性有别于样本来源，因此没有通用的正交组合。当根据样品中成分的物理化学性质如尺寸、电荷、极性、疏水性等选出恰当的固定相和流动相后，才有可能构建出比较成功的正交组合。目前，可以得到多种多样的固定相，它们在表面化学、支撑材料、碳负荷、孔径等方面都有区别，而流动相的特性可以通过调整改性剂、pH、温度或加入离子对试剂等方式改变。在多维结构中应用两组RP-LC，如果流动相组成是经过优化的（两维中具有不同的pH），则可以在分离多肽时具有较高的正交性95-97。当一系列分析物具有相似的物理化学性质并在两维中具有相似的行为时，正交的两维中的保留可能仍具有弱相关性。例如，可以将SECRP-LC看作正交组合，但对于特定的混合物，按尺寸分离可能与RP保留有相关性。同样，离子交换IEX主要在电荷的基础上分离分析物，但也可能体现出疏水作用。与其他正交二维系统相比，研究人员可能认为亲水作用液相色谱（HILIC）与RP-LC负相关，即在RP-LC上保留不明显的混合物在HILIC上有大的k值，反之亦然。然而，研究表明事实并非如此，HILIC中的相互作用不能单独地由亲水作用解释96。因此，正交性的定义不仅仅关注两维之间的选择性差别，而且更应该关注分析物保留的独立性。尽管正交性的概念非常重要，但很少有文献从数学的角度讨论这个问题。Massart的研究小组利用主成分分析（Principal component analysis, PCA）探讨了正交性98-101。他们通过对一系列化合物在许多固定相上的保留数据作“加权平均连接树图”，进而研究了保留因子的相关性。由于这些实验都是独立开展的，所得结果为相对于综合操作的实际结果。因此，他们的结果仅仅提供了关于“在线系统中固定相的哪种组合可得到高的正交性”的有用信息。Liu等102利用气相色谱数据做了测定，并提出了峰展开角的测定方法。Gilar103指出，许多2DLC系统并没有清晰的分界区域，并提出了Binning方法测定有效区域和实际峰容量。Liu等人92提出了一种关于因子分析的几何学的方法，其中相关系数矩阵通过溶质的保留参数得到。由洗脱峰覆盖的二维分离空间的有效面积是正交性的决定因素，并且被作为差减因子用于理论峰容量，以便建立真实的实际值。检验正交性的另外一种方法是使用信息理论93, 94。Slonecker等104利用特定的目标样品，在不同类型的色谱柱上进行一维分离，通过比较每一样品的保留值变化，以确定哪种组合方式具有最大了正交性和最小的相关性。提出了信息熵、信息相似性和交互信息等术语表征2DLC的正交性，二维色谱系统的信息相似性测量的是所有样品的拥挤现象和维度饱和性，如Erni和Frei105早期的描述。在这两种方法中，保留值数据由Steuer等人106提出的方法进行标准化，以便于进行比较。通过这种方法，列格式和粒子特性不再影响进一步的计算。交互信息为0%表示二维色谱系统中各位的保留机理不同，交互信息为100%表示二维色谱系统中各位的保留机理相同。在综合分离中，信息论和因子分析对于分离潜能的预测是很有用的工具，对此，Gray等人107-109通过对oligostyrenes的同分异构体构成的复杂混合物的RP-LCRP-LC分离，从理论和实验的角度进行了评价。在四组测试中，只有一组ODS（流动相为甲醇）和碳沉积氧化锆（流动相为乙腈）组合中分离出的组份数超过预测值，其余三组结果并不理想，未达到预期效果。Gilar等人96于2005年再次检验了正交性的概念。正交性被定义为通过在二维分离空间中对标准化的保留值数据作图并对每个数据点指定峰面积后，由洗脱峰覆盖的标准化的面积。选择的模式包括RP-LC，强阳离子交换（SCX）LC，SEC及HILIC等在2D-LC中不同的组合，并用于多肽分离。实验中总是由低pH下的RP-LC进行第二维分离，这一点很好地模拟了实际状况下的应用，因为RP-LC通常是作为后期分离与MS联用。研究结果表明，从未实现完全意义上的正交性，并且对于一个理想的正交分离，提出了表面覆盖率63%的假说。根据SCXRP与RPRP（不同的pH条件）之间的比较后发现，两种组合具有相似的正交性，RP-LCRP-LC得到了最高的峰容量（这是由于SCX-LCRP-LC中第一维SCX-LC本身分离能力较低的缘故）。Gray等110第一维使用RPLC，第二维使用碳沉积氧化锆固定相，利用信息理论和展开角考评了其系统的正交性。Watson等人111断言这种方法对于以低峰容量为特性的分离是例外情况，方法对理想的正交分离具备63%的表面覆盖率的假说过于高估，其观测对于2D-LC分离中的第二维很重要。正交性测定的不同方法容易使色谱工作者产生混淆，有碍于评价不同研究小组之间二维分离结果。诸多实验室甚至不用正交性的衡量，他们的结果就容易被过高的估计。1.2.3. 采样频率为极大限度地保持第一维中在全多维分离下所得到的分辨率，必须在第一维上沿洗脱方向转移大量的馏分。当采样频率或循环周期大于在第一维柱上分离峰宽时将会显著降低第一维的分离能力，因为在导入第二维之前会出现混合过程。若通过第一维分离的化合物被收集于同一馏分，则丧失了其分离效果。换句话说，第二维上的快速分析是全多维的先决条件，这意味着在第二维只有很短的分离时间，因此第二维上的峰容量相对较低。高通量与充分分离是比较难以同时实现的。因此，第一维上的峰有时会由于采用较低的流速而展宽。第一维低流速运行一方面给一维色谱峰有足够的采样次数，另一方面由于流速低于范第姆特最优条件而严重降低第一维的峰容量。许多研究者认识到了采样频率对于整体二维分离中峰容量的影响，但有效地处理了这个问题的报道数量很少。Murphy等人4研究了采样频率对于实际的第一维峰宽的影响，并将每个采样周期内平均浓度的直方图得到了一个高斯峰的模型。在理论和实验的基础上，他们得出的重要结论是：为了避免极大降低第一维中分离度，在每个第一维峰的峰宽8倍标准偏差（8）相当的时间内采样三次即足够。然而这个次数仅仅适用于同相（in-phase）采样，即必须准确的在出峰时开始采样。实际操作中，不能确保满足这个条件，因此建议以最小四次采样代替。多数研究者是以峰宽4研究充足的采样频率的影响，而不用8。Seeley112从理论的角度研究了采样频率。一方面，当收集整个采样周期内的一维流出物时，分离周期为一个单位。例如，当接口为配有两个样品环的两位十通阀或八通阀时。当接口不能完整采样一维馏分时，则分离周期小于一个单位。例如使用配有一个样品环的两位六通阀为接口时。Seeley通过引入一个采样周期和采样阶段的参数定义了（平均）峰展宽因子。由循环周期或采样时间ts以及第一维峰的确定，而表示初级峰被切割的方式。当以一个采样周期进行中心化以及低的分离周期时，峰展宽不显著。对分离为1的大多数全多维分离系统，峰展宽实际上不受的影响。Seeley在100%分离周期下得到了与Murphy等人4一致的结论。Horie等人83采用了Seeley的定义并且发现，循环周期等于的2.22.4倍时足够使峰展宽最小化。在他们的工作中，一维分离在梯度条件下进行，而第二维则在填充柱（粒径2或5m）和整体上进行等度分离。在比上述建议较短的循环周期内，在一维峰中得到了较多的馏分，然而在第二维柱上没有得到足够的分离能力。相比之下，采用较长的采样周期结合较长的色谱柱可以改进第二维的分离度，但是会由于采样不足的影响而导致整体分离度的损失。尽管如此，在柱外峰展宽方面，这种方法还是比较有利的，而且可简化操作。Carr的研究小组最近发表了一些关于采样不足对总分离的影响的报道。与前人的所有研究相比，他们的结果是仅基于一对峰113-115。他们以一个平均第一维峰展宽因子作为采样时间（ts）和采样前第一维峰的标准偏差（）的函数，联合乘积法则用于计算实际峰容量67，如（5）式所示：当有效 (5)2D统计重叠理论116连同模拟全二维分离中观测到的峰数目被用于确定该因子。与前人工作4, 83, 112相比，本工作中确定的峰展宽因子相对要大235%，其对总峰容量有很大的影响。基于这些发现，该小组最近又推出了一个简单且准确的公式，用于计算相对较短的2DLC分离中的有效峰容量，其中两维条件均为梯度115。如式（6）所示，表示第一维梯度时间，表示第二维分离循环时间。后者假定等于采样时间ts。（6）他们的方法简单之处是基于严重采样不足的，其结果是对于较长的第二维梯度时间（1 min）及较短的第一维梯度时间（30 min），鲁棒性和准确性都很高。该研究工作中一个令人吃惊的发现是在一个相当宽的条件范围内，2D-LC的总峰容量仅仅轻微地依赖于第一维峰容量，特别是快速第一维梯度的情况下。这就是说，对于此类研究，不必花费大量的时间和精力去优化第一维的峰容量。当第一维操作非常缓慢时，这种依赖性对于实际峰容量的增加和近似计算结果的比较非常关键。在上述方法中，假定两维中的保留机制是不相关的。然而，作者没有考虑非正交2D分离时模型的可靠性问题。1.3. 二维液相色谱系统构建及方法建立二维液相色谱是将两种分离机理不同而又相互独立的液相分离模式串联起来构成的分离系统，第一维使用一根色谱柱，也可以是多根分离模式相同的色谱柱串联；第二维使用一根色谱柱，也可以是多根相同或不同的色谱柱并联。样品经过第一维的色谱柱分离进入接口中，通过浓缩、捕集或切割后被转移进入第二维色谱柱及检测器中。1.3.1. 二维液相色谱系统组成全二维液相色谱系统由两个泵、两支色谱柱、进样器、接口和检测器组成。一种典型配置117如图11所示，由两位十通阀和两个样品环连接两维分离系统，两个样品环交替进行第一维馏分收集和再进样到第二维色谱柱。从分析的角度考虑，可以把第二维色谱柱和检测器看作是第一维分离组份的化学选择性检测118，接口相当于采样装置。根据每一维是否采用梯度，各维度的装置有所不同。图11典型十通阀连接二维液相色谱系统Figure 11 Common comprehensive set-up with two-position/10-port switching valve1.3.2. 分离模式组合二维液相色谱使用两支或多支色谱柱，并通过一定的切换接口实现样品的转移。根据被切割组份是否全部进入第二维中，二维系统分为部分和整体柱切换两种模式；根据切割组份是否直接进入第二维中，分为离线和在线两种模式。部分模式通常采用中心切割（Heart cutting）技术，对第一维洗脱的样品组份只将感兴趣的部分导入第二维进一步分析。整体模式是将第一维洗脱的样品组份全部导入第二维中继续分析。与部分模式相比，整体模式能得到全部样品组份的信息。另外，在采用分流技术的二维系统中，虽然只有部分样品进入第二维系统中，但是只要这部分样品能代表全部样品组份的信息，也属于全二维系统的范畴。在近年蛋白质组样品的大规模高通量分析中，整体切割方式因为能获得较多的样品信息而在全二维液相色谱中广泛应用。离线模式是将第一维洗脱的馏分收集起来，经过处理然后再进样到第二维中，比在线模式具有更好的灵活性，可以只收集感兴趣的馏分，也实现全二维分析。因为可以对两维分别进行独立的分离优化，所以可以实现分离能力大幅的提升。但是进行离线切割、转移样品操作可能带来样品的污染及浪费，而且自动化程度低、分析重现性也较差。近年来，随着自动馏分收集器和样品富集浓缩技术的发展，离线模式也得到了很大程度的改善和提高。在线分析指的是被分析物在两维之间自动切换而无停流的系统119，典型配置为两位十通阀连接样品环或者捕集柱对第一维流出的样品进行收集，然后切换阀导入到第二维中进行分析。在线模式避免了离线方法中样品易污染浪费、操作步骤繁琐、分析时间长等缺点，具有较高的准确性和精确性，降低了分析时间，易于实现自动化。随着现代仪器的发展和自动化分离的需要，在线二维系统得到了广泛的应用120。但在线模式必须要考虑两维溶剂的兼容性、第二维的最大进样量和分离速度。同时，在线模式也存在着设备复杂、两维之间需要特殊接口等缺点。1.3.3. 方法建立的一般程序在一维液相色谱方法建立中121-124，分析人员需要选择柱填料类型、颗粒大小、流速、检测器和样品处理，这些条件都是紧密关联的。在二维液相色谱方法建立时，需要考虑的两个分离机理不同的色谱柱的放置，及其各自色谱条件的选取，最重要的是让两维的色谱条件共同实现分离目的。Shoenmakers等125提出了建立全二维液相色谱系统时如何选择色谱柱规格（长度和内径）、填料大小、流速和第二维进样体积（样品环大小），以及应使第一维的保留时间尽可能长（第一维分析时间基本等于二维总分析时间）、确定两维的最大运行压力和第一维色谱柱的最小内径等理论指导。下面是方法建立中的一些基本准则：色谱柱选择：色谱柱保留机理的相关性必须最小，即正交最大化。采样：第二维色谱柱必须足够快，以最优化对第一维的采样。二维方法建立时要先建立第二维分析方法。第二维的采样速率应保持应维持每个峰采样3-4次。溶剂系统和梯度洗脱：第一维的溶剂必须与第二维相匹配。当使用RPLC时，梯度洗脱较理想。因为梯度洗脱的聚焦效果，可以使峰型变窄。盐梯度洗脱在两维中均可使用，然而，这将对质谱的使用造成一定的困难。第二维洗脱时间的范围：第二维的洗脱时间必须进行限定，这将影响第二维的性能。洗脱时间可以通过梯度洗脱和或改变流速调整，以决定采样频率。样品环的体积：样品环的体积，除以第二维的分析时间就是第一维的流速。如果第二维的稀释因子较小，若第一维的流速很大可使用分流器可是维持较小的样品环体积。第一维的优化：流速、洗脱时间和柱效必须控制以与第二维的样品环体积和采样频率匹配。在实验开始之前，首先要确定实验的目的。例如，目的是试图分离所有可能的峰或者是利用两维分离以确定两相间的相互作用，多数生物复杂样品分离的目的是增加分离度等。然后根据以上原则不断优化，最终获得较好的分离结果。1.3.4. 色谱柱的选择基于不同的分离目的，可以采用不同分离机理的柱系统构建多维液相色谱分离系统，离子交换色谱（IEC）、反相色谱（RPLC）、亲和色谱（AC）、尺寸排阻色谱（SEC）和正相色谱（NP）等分离模式皆可以组合用于特殊目的的分离。对于两种分离模式的组合，不仅应考虑分离选择性、流动相兼容性、分辨率、峰容量、柱容量及分析速度等因素，对于生物样品的分离、样品回收率和活性等因素也可能非常重要。在实际多维分离系统的构建过程中，必须综合考虑不同因素的影响，选择合理的分离模式和柱系统。具有高峰容量和样品容量的色谱柱常用在第一维，如IEC、HIC、NPLC和RPLC；具有快速特点的色谱柱用在第二维，如SEC和RPLC。建立合适的2D-LC系统，可以参考已有文献资料选择恰当的色谱柱。如果了解样品的信息则对色谱柱选择极有帮助，例如某类样品带有明显的分离特征（如分子见带电状态和疏水性），则可选择离子交换和反相分离。IEX/RP二维系统已经是分离蛋白质和多肽的成熟技术。此外，如果分子中具有两类截然不同的官能团，则可以考虑使用正相（NP）和反相（RP）分离体系。RPLC可以说是色谱里面的主力，在任何情况下使用，第一维和第二维均可。如果样品保留较强造成运行时间较长，在第一维使用较合适；反之，可以用作快速第二维126。对于合成或天然的聚合物，首先选择的是RPLC/SEC系统。因为SEC具有一定的洗脱限，因此，可以用作快速二维，时间在1-2min4, 117。如果样品分子量小且具有一定的极性，使用RPLC和NPLC联用的的二维色谱可以显示出较高的分离能力126。Carr倡导7使用不同类型的RP柱构建二维系统分析小分子的代谢物组学产物，例如：五氟苯丙基固定相/碳包裹氧化锆基质固定相模式。1.4. 二维液相色谱接口技术接口是二维液相色谱的核心，接口的设计决定了二维联用系统的实际分离效能，也是限制二维液相色谱发展和应用的瓶颈。之前的文章34, 38, 127将按连接方式将接口分为定量环接口、捕集柱接口、整体无接口式二维系统。本节根据样品经过接口后状态变化进行分类，分成柱内转移接口、柱间转移接口、富集式接口和稀释式接口，对二维液相色谱接口技术近期发展和应用进行总结。1.4.1. 柱内转移接口样品经过两种机理分离时不转移出柱外，称为柱内转移接口，包括连续二维液相色谱模式和单柱二维液相色谱模式等。a) 连续二维液相色谱系统（directly coupled column interface）连续二维模式不用接口，两维色谱柱直接连接，第一维的流出物直接、连续地进入第二维。直接转移模式仅需要一个梯度泵，是最简单的二维液相色谱系统128, 129。我们课题组份别构建了HILIC-RP连续二维液相色谱系统，分离六味地黄丸时识别出的峰个数比一维反相分离增加了60%。构建了ZIC-HILIC-RP连续二维液相色谱系统，成功应用于多肽、人血清和天麻的分离。两种分离机理的色谱柱直接联用时，两维都必须进行梯度洗脱，否则第一维已经分离的组份会在第二维重新混合。b) 多维蛋白质识别技术（multidimensional protein identification technology， MudPIT）Yates等130-132提出，是在一支色谱柱内依次填充两种或多种不同分离机理的色谱填料，多种填料直接相连133。采用多步增加盐浓度的方式洗脱SCX柱132、脱盐、梯度RP分析的步骤。色谱柱的末端拉成尖端直接连接质谱，对蛋白质定性。一次分析，MudPIT技术可以定性分析超过1000个蛋白质，整个MudPIT系统的峰容量可达到23000，二维液相色谱部分的峰容量约为3200。Dayin等130描述MudPIT试验的主要步骤，一是样品预处理，二是两相式毛细管色谱柱的制作及搭建二维分析平台，三是2D-LC-MS/MS分离样品，四是数据分析处理。Link等134首次使用MudPIT系统识别了32个40S核醣体蛋白中的30个，与1D RP相比，二维MudPIT系统识别的肽数增加，与DALPC技术相比，检测限由1000 fmol提高到10 fmol。Wolters等132改进了Link等20的MudPIT系统，分析S. cerevisiae蛋白质组，识别出630个蛋白质。进一步改进系统，将样品分成三部分，分别进行2D分析，识别出1484个蛋白质131。而使用2D-GE技术最多只能识别279个蛋白质。Kislinger等135以MudPIT为分离复杂组份的核心技术组建了哺乳动物细胞、组织蛋白质组大规模分析的系统平台PRISM（Proteomic Investigation Strategy for Mammals），识别出成年鼠肺及鼠肝蛋白质组中的2106个蛋白质。Wenner等136分析人脑室的脑脊髓流体（CSF）蛋白质组，识别出249个蛋白质。Koller等137在稻米蛋白质组中识别出2363个蛋白质，Florens等138在Plasmodium蛋白质组中识别出2415个蛋白质。Paul Taylor等139识别了murine C2C12 cells中的1428 个蛋白质（11078 肽）。Richard R. Drake等140识别了前列腺癌症患者前列腺分泌物中的916个特有蛋白质。McDonald等141进一步改进了MudPIT系统，在一支色谱柱内依次填充RP、SCX、RP填料（6.5cm RP+3.0cm SCX+3.0cm RP），组成三相式MudPIT系统。分析bovine brain microtubules时识别了62个蛋白质，超过了一维 RP（26个）及二维MudPIT系统（55个），显示出在复杂组份分析中的优势。Guzzetta和Kang等142, 143采用一个T形接口实现了三相MudPIT系统和RPLC分析柱的联用，提高了MudPIT技术的自动化程度，实现了系统的快速和大体积上样。Taylor等144将传统的MudPIT技术与纳升级的RPLC联用，将人类骨髓癌细胞分泌蛋白质的鉴定数量比传统MudPIT技术提高20%-30%。为了进一步提高系统的分析通量，超高压液相色谱145和整体柱技术146也被用于MudPIT系统中。阴阳离子混合床代替SCX作为第一维，不仅将酵母全蛋白酶解产物中鉴定的肽段数目增加了一倍，而且鉴定的磷酸化肽段的数量比单独采用SCX作为第一维的分离模式提高了94%147。Tao等148使用超长色谱柱为第二维，缩短第一维盐梯度步骤从而缩短总分析时间。Garbis等149构建了ZIC-HILIC串联RPLC模式的MudPIT，识别了血清中1955个蛋白和375个磷酸化蛋白。c）单柱二维耿信笃等150, 151提出了用一根色谱柱来实现离子交换和疏水色谱快速分离整体蛋白的新方法。在选择合适的固定相、流动相、缓冲液交换方法及二次进样的条件下152，在1 h内用一根色谱柱完成了通常用两根色谱柱和在两种流动相条件才能实现的“二维色谱”分离，并且能维持蛋白原有的三维和四维分子结构，并成功应用于牛胰腺中活性蛋白的分离153。1.4.2. 柱间转移接口样品从第一维转移到第二维过程中，不经过处理，到达第二维分离时保持第一维分离后的浓度和组份状态，称为柱间转移接口，包括定量环接口、平行柱接口和停流接口。a) 样品环接口（loop interface）样品环接口通常由两个相同体积的样品环和两位十通阀5, 21, 22, 28, 154-167或两位八通阀组成1, 16, 126, 164, 168-170，也可以组合使用多个六通阀109, 155, 165, 171。一个样品环收集存储第一维洗脱产物，另一个样品环中存储的馏分转移到第二维中进行分离，两个样品环交替进行。1978年，Erni和Frei16用一个八通阀和两个样品环构建了SEC/RP二维液相色谱系统，用于分析植物提取物。随后，这种技术被广泛接受，用于各种二维液相色谱系统。样品环接口结构简单，操作方便，通用性强，是二维液相色谱中应用最为广泛的一种接口。样品环的体积由第一维的流量和第二维的分离时间决定，可以通过改变样品环的体积来改变第二维的进样量。样品环接口的缺点127, 172, 173是：样品环增加了系统的死体积；第二维的进样体积限制了样品环的体积和第一维的流量；第一维的流动相会对第二维的分离造成影响；稀释效应会降低系统的灵敏度。另外，当两个定量环“不对称 ”时，样品的保留时间会有差异117。需要指出的是，当样品环接口采用八通阀设计时，两个样品环中流动相的流向不同，是“不对称”的。并且，要实现全二维分析，样品环体积要远大于所收集馏分的体积，这是因为馏分在定量环中成抛物线分布。而实际应用中较少人遵守这一规则127。b) 平行柱接口（interface with parallel second dimension columns）平行柱系统为使用两支（或两支以上）色谱柱平行进行第二维分析第一维中相继洗脱出来的馏分38, 174, 175。其中，两支平行柱上的分离时间和效率一致，才能进行色谱图整合以获得全部分离的色谱图或等高线图。平行柱接口运行的困难是如何使几支色谱柱协调176运行。使用同一厂家同一批次的色谱柱和优化系统（调整管路长度等）显得格外重要44。将样品环接口（两位十通阀连接）中的样品环用第二维分离色谱柱代替即可构建平行柱二维系统177-181。平行柱接口是将第一维的洗脱产物直接转移到第二维分析柱的柱头，在第二维柱头实现样品的富集浓缩。Opiteck等178, 182使用了两个四通阀构建了SECRP平行柱系统。Unger等181, 183以两支平行的14mm4.6mmI.D.反相色谱柱作为第二维，通过10通阀切换，对第一维离子交换色谱柱的馏分每分钟切割一次。在多数情况下，第二维应使用相同的色谱柱，其对样品的保留行为必须严格相同。但Haefliger177报道了使用两根不同的色谱柱（C2和C4）为第二维的平行柱接口RP-RP二维液相色谱系统，用于表面活性剂的分析。由于流动相兼容性和第二维分离速度的限制，第一维洗脱产物只能被切割成4个馏分进入第二维。为了增加第二维平行柱的分离度，我们课题组184在平行柱后串联一支反相柱，延长了分离空间，有效地提高了峰容量。尽管有报道第二维的采样时间仅0.2 min和1 min，多数第二维的分析循环时间为几分钟。Wagner等181, 185使用仅14 mm长的无孔反相色谱柱为第二维，构建了IEXRP二维系统用于分离蛋白质，流量为2.5 mL/min时，采样时间仅1 min。大孔的C4柱186、无孔的C18键合硅胶柱187、也被用于加快第二维的分离速度。Murahashi等166度运行分离两支5cm C18整体柱构建了RPRP二维系统分离多环芳烃，流量高达 16 mL/min（100%有机相），采样时间仅0.2 min。为了提高系统的峰容量，Wagner等185使用了4根平行柱作为第二维，构建了IEX-RP二维液相色谱系统，用于多肽和蛋白质的分析。一支色谱柱上样，两支色谱柱分析，第四支色谱柱再生同时进行，极大地提高了系统的峰容量176，同时也使得系统超级复杂。张祥民等188以SCX作为第一维分离模式，10根平行的RP柱作为第二维分离模式，构建了2D-SCX/（阵列）RP系统，并从肝癌组织中提取的蛋白质酶解产物中鉴定出1202种蛋白质。c) 样品环-平行柱接口（loop-parallel column interface）尽管增加采样速率对系统峰容量有利，但全二维液相色谱系统装置限制了第二维的分析时间，从而不可避免地限制了第二维的分离空间。同时，由于流动相不兼容，进一步减少了第二维的分离空间127。将平行柱接口与样品环接口或捕集柱接口组合使用，可以提高系统的峰容量。常规平行柱接口的采样时间与第二维的分析循环时间相同，而增加定量环（或捕集柱）后，馏分的收集不会影响到第二维的分离和再生，样品环交替进样到第二维的方式使得第二维的分析时间可以是采样时间的两倍，从而第二维的峰容量是之前的两倍，极大地增加了系统峰容量。Venkatramani等189-191用一个12通阀连接3个样品环和两支反相柱构建了RP/RP二维液相色谱系统，切割时间仅为12 s。Tanaka等192使用两个六通阀（每个阀配备有一个样品环）构建了RP-LCRP-LC 系统。Francois等23以2个十通阀连接2个样品环和两个平行柱构建了NP/2RP二维液相色谱系统，分析柠檬油萃取物的系统峰容量从497（NP/RP）增加到1095（NP/2RP）。所构建的RP-LC2RP-LC系统的采样时间减少到30 s97。d) 停流接口（stop-flow interface）停流接口是使用一个多通切换阀连接两维色谱柱127, 193。第一维洗脱产物直接转移到第二维色谱柱柱头后，第一维系统停流，进行第二维分离。第二维分离结束后，再进行下一循环，直至所有组份均经过二维分离194。停流接口的优点是第二维分离时间没有限制，可以获得很高的分辨率和峰容量9, 195，两维之间没有死体积。其缺点是分离时间长，第一维的停流可能会造成峰展宽、变形。因此，两维流动相兼容和使样品在第二维柱头能够重新聚焦以降低峰宽展宽196。Kohne等使用两个197或三个198六通阀设计了停流进样接口，通过柱头的峰压缩减少了第一维的峰宽展宽。Blahova等199使用一个六通阀建立了停流接口RP/RP二维液相色谱系统，用来分析啤酒和啤酒花的萃取物，正交性较高。Bedani等196建立了类似配置的停流接口SEC/RP二维液相色谱系统。1.4.3. 富集式接口馏分从第一维洗脱出来之后，经过富集、浓缩后转移到第二维进行分析，有效地降低了峰展宽，称为富集式接口，包括捕集柱接口、捕集柱-平行柱、溶剂蒸发接口等。a）捕集柱接口（packed loop interface）捕集柱接口通常是由两个相同的捕集柱和多通切换阀组成，从第一维洗脱下来的馏分到达捕集柱后，馏分中的组份在捕集柱柱头富集，完成后反冲捕集柱上的样品到第二维进行分离，捕集柱起到在两维间形成溶质“重新聚焦”的作用67, 180, 200-202。捕集柱在第一维流动相洗脱条件下对样品的保留能力比第一维强，在第二维流动相洗脱条件下易于洗脱。当第一维洗脱产物流经捕集柱时，溶质在捕集柱头被富集浓缩，切换阀后，第二维溶剂将经过捕集柱富集浓缩的组份反冲入第二维进一步分离。捕集柱接口克服了样品环接口缺点，但是对捕集柱的填料、两维的流动相有所限制。Greibrokk等使用两位/十通阀连接两个与第二维填料相同的保护柱作为接口，构建了IEX x RP二维液相色谱系统，对第一维分别使用盐梯度203和pH梯度进行洗脱201, 204。Cacciola等162, 180采用相同的结构构建了RP/RP二维液相色谱系统，用于酚类和黄酮类抗氧化剂的分离。为了加快第二维的分离速度和使系统更稳定，可以在第二使用高温分离205。b）捕集柱-平行柱（packed loop-parallel column interface）与样品环-平行柱接口类似增加或捕集柱后，馏分的收集不会影响到第二维的分离和再生，捕集柱交替进样到第二维的方式使得第二维的分析时间可以是采样时间的两倍，从而第二维的峰容量是之前的两倍，极大地增加了系统峰容量。Venkatramani等189用一个12通阀，3个捕集柱构建了RP/2RP二维液相色谱系统，切割时间仅为12 s。c）捕集柱阵列（SPE array interface）使用多个捕集柱同时富集第一维洗脱下来的馏分，从而给第二维分离以充足的时间，可以实现更高的峰容量。Wilson等202, 206使用两个捕集柱阵列（每个阵列含9个捕集柱）构建了亲水作用色谱HILIC/RP二维液相色谱系统，第二维的分离时间不受第一维的限制，达到了53 min，可以获得很高的分辨率和峰容量。张祥民等207将强阳离子交换分离的18个组份捕集到18根预柱上后，再将其转移至18根毛细管RP柱上进行分离，最后直接点样至基体辅助激光解吸离子化质谱的靶板上进行鉴定。与传统的SCX/RP系统相比，可将蛋白质组样品的分离时间由54 h缩短至3 h，分离通量提高18倍。d）真空辅助溶剂蒸发接口（vacuum-assisted evaporation interface）关亚风实验室发展出了一种新型的NP/RP接口真空辅助溶剂蒸发接口208-210。第一维的洗脱产物到达接口时，第一维溶剂在真空辅助下蒸发，而样品在样品环中得以保留。通过第二维流动相将样品环中保留的馏分导入第二维进行分离。真