琼脂糖凝胶电泳PPT课件.ppt

琼脂糖凝胶电泳 与蛋白质分子相类似 核酸分子也是两性电解质 在pH3 5时 核酸分子带正电荷 在电场中向负极移动 在pH8 0 8 3时 碱基几乎不解离 磷酸全部解离 核酸分子带负电荷 在电场中向正极移动 琼脂糖凝胶电泳是采用琼脂糖凝胶作为电泳支持物的一种简单 快速分离纯化和鉴定核酸特别是DNA的方法 琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取出来的 为一种聚合链线性分子 琼脂糖凝胶的孔经较大 主要用于分离较大片段的DNA分子 100bp 60kb 一 电泳基本原理 1 不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同 在自由泳动时 各核酸分子的迁移率区别很小 难以分开 但采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物 发挥分子筛的功能 使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率产生较大的差别 则可达到分离的目的 DNA片段在凝胶上移动的距离在一定范围内是分子质量的函数 分子质量越大 移动越缓慢 因此 利用琼脂糖凝胶电泳相对于标准DNA的移动度 可测定DNA片段的相对分子质量 2 琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围 胶浓度 线性DNA分子大小 kb 0 35 600 61 200 70 8 100 90 5 71 20 4 61 50 2 42 00 1 3 3 二 仪器设备及材料 1 电泳装置 包括电泳槽 多采用水平方式 胶床和梳子三部分组成 2 稳压电泳仪 电压可变范围0 300 600V 电流可变范围0 250 500mA 3 紫外线检测仪 可产生254 302 366nm3个波段紫外线 并配备防护眼镜和5mm厚的黑色有机玻璃防护板 4 照相机 5 微波炉 6 其它 三角烧瓶 量筒 胶带纸 一次性手套等 4 三 主要试剂 2 电泳缓冲液 常用的缓冲液有TBE TAE和TPE三种 5 4 10mg ml溴化乙锭 EB 贮存液在100ml水中加入1g溴化乙锭 磁力搅拌数小时确保其完全溶解 棕色瓶室温保存 6 2020 2 6 7 溴化乙锭 EB 染色原理 溴化乙锭是一种荧光染料 其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间 在紫外线的激发下 发出橙色荧光 这是因为 在紫外线照射时 核酸吸收波长为254nm的紫外线并将能量传递给溴化乙锭 同时嵌入在核酸碱基间的溴化乙锭吸收302nm和366nm波长的紫外线 来自两方面的能量最终激发出波长为590nm的红橙色可见荧光 8 溴化乙锭用于核酸染色的优点 染色操作简单 一般在凝胶中加入终浓度0 5 g ml的EB即可 在电泳过程中随时可以观察核酸的泳动 也可在电泳结束后 将凝胶浸泡在EB里30分钟即可 EB染色不会引起核酸的断裂 其它染料做不到这一点 EB染色灵敏度较高 可以检测出10ng的DNA样品 溴化乙锭缺点 EB是一种强诱变剂 并有中度毒性 注意 操作中务必带上防护用手套 如不慎皮肤与溶液接触 应立即用清水彻底冲洗 含溴化乙锭的溶液使用后应进行净化处理 使其致诱变活性下降为原来的1 200左右 方可丢弃 9 四 电泳操作步骤 2 胶床准备 取出洗净并晒干的胶床和梳子 在胶床未封闭的两端贴上胶布或胶带纸 形成约5 8mm的挡墙 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内 梳齿底端和床面有1mm的间隙 将胶床放在调整好的水平台上 1 凝胶准备 用0 5 TBE配制2 琼脂糖凝胶 称2g琼脂糖置三角瓶中 加100ml0 5 TBE 微波炉加热大约1分钟 熔化琼脂糖 熔化的琼脂糖自然冷却到60 70 时 加入EB0 5 g ml 并轻轻混匀 10 3 铺胶 将冷却致60 的凝胶倒入准备好的胶床内 凝胶厚度3 5mm 4 室温下静置1小时左右 凝胶固化 撕去胶床两端的胶带纸 将带凝胶的胶床置于电泳槽中 并使样品孔位于电场负极 5 向电泳槽中加入0 5 TBE电泳缓冲液 以越过凝胶表面1 2mm为宜 6 轻轻拔出固定在凝胶中的梳子 原梳齿处 样品孔 即被缓冲液充满 如发现有气泡 应设法去除 7 样品准备 向核酸样品中加入约为样品体积1 6的上样缓冲液 用加样器轻轻混匀 11 8 上样 用加样器吸取样品 轻轻的加入到凝胶的样品孔中 加样量一般10 30 l 9 盖上电泳槽 接通电源 开始电泳 开始电泳前 再次确认凝胶样品孔处于电场的负极 电泳条件 电压1 5v cm 时间1小时左右 10 电泳结束后 切断电源 取出凝胶 11 电泳结果分析 紫外检测仪直接观察电源条带 摄影记录 凝胶成像分析系统处理 12 五 注意事项 1 凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定 所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计 2 用胶带纸封闭胶床两端时 要确保严密 以免灌胶时有胶液漏出 3 用微波炉熔化琼脂糖时 应控制好时间 以免突然产生气泡 使琼脂糖溢出来 4 凝胶冷却至60 左右 立即铺胶 以防凝固 5 上样前检查样品孔内是否有气泡 并设法排除