分析化学选论.doc

一、试述毛细管电泳的基本原理，特点及其发展趋势电泳分离的基础 n = meEn为离子移动的速度; me为电泳迁移率; E为毛细管柱进样端至检测窗口间电场强度。离子的电泳迁移率不同，在电场中移动的速度不一样，利用这个原理可以把不同的离子彼此分离。电泳迁移率与分析物质所带电荷呈正比，与摩擦阻力系数呈反比。如果两种物质带有不同的电荷或者通过缓冲溶液移动的摩擦力不同，那么这两种物质可以彼此分离。优点：1高质量灵敏度：常用紫外检测器检测限可达10-13一10-15mol，激光诱导荧光检测器(LIF)则达10-19一10-21mol。 2高分辨率：每米理论塔板数为几十万，高者可达几百万乃至几千万 3高速度：许多分析可在几十秒内完成所需样品少：只需纳升(10-9)的进样量。 4成本低：只需少量的流动相和低廉的毛细管。 5应用范围广：除分离生物大分子外，还可用于小分子(氨基酸、药物等)及离子(无机及有机离子)甚至可分离各种颗粒(如细胞、硅胶颗粒等)。缺点：1进样不够方便，应用范围相对狭窄。 2分析阴离子时，由阴极进样，在阳极检测，但电渗流方向与阴离子受电场力作用移动方向相反，出峰时间较长。 3由于检测池的体积小和光路短,紫外法的应用受到一定的限制。发展趋势：21世纪将是生命科学大发展的世纪。完成人类基因组计划后，后基因时代的基因组学和蛋白组学将快速发展，功能基因的分离、检测，功能蛋白的分离、测定对CE提出更高的期望。 小chip将是CE发展的一个重要趋向，将一个实验室的工作集成到一块很小的芯片上，能使仪器微形化。可以预见，不久就会出现各种专用的基因检测、疾病诊断的小型chip及仪器。将会研制适合CE用的各种检测器，以进行单细胞和单分子的检测。单细胞检测为在分子水平上了解细胞的各种行为提供了强有力的工具，而单分子检测为在单个分子水平上开展化学动力学，反应动力学等研究提供了可能性。此外，CE在环境科学中也会有较大发展余地。 CE是正在发展的研究领域，有很多理论及实际问题有待解决，更需其它领域的研究人员来扩大其应用范围。CE的成长将为生命科学、材料科学、环境科学提供又一强有力的研究手段，CE也在不断解决难题的过程中得到发展。二、 化学发光免疫分析的类型有几种？其特点各是什么？1、直接化学发光免疫分析直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光 。 由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。2、化学发光酶免疫分析是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底 物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。3、电化学发光免疫分析 是以电化学发光剂三联吡啶钌标记 抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体， 在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。4、临床应用化学发光免疫分析的优点1)、灵敏度高： 这是CLIA关键的优越性，其灵敏度可达10-16/-21mol/L（RIA为10-12mol/L）。又如化学发光底物（如AMPPD）可检测出的碱性磷酸酶的浓度比显色底物要灵敏5105倍2)线性范围宽： 发光强度在46个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系。这与显色的酶免疫分析吸光度（OD值）为2.0的范围相比，优势明显。也优于放射免疫分析技术。3)、安全性好： 彻底消除了放射性危害，环保、安全。 到目前为止，还未发现CLIA的危害性。4)、试剂有效期长 有效期可长达1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的衰变，一般有效期只有一个月，而酶免的底物贮存性差，都无法与化学发光相比，有效期长可以降低使用成本，利于推广应用。5)、光信号持续时间长 辉光型（glow type）的CLIA产生的光信号持续时间可达数小时甚至一天。简化了实验操作及测量。容易实现连续、动态、重复测定 6)、分析方法简便快速 绝大多数分析测定均为仅需加入一种试剂（或复合试剂）的一步模式，容易实现自动化。7)、结果稳定、误差小 样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免除了各种可能因素（光源稳定性、光散射、光波选择器等）给分析带来的影响，使分析结果灵敏稳定可靠。8)、临床应用广(1）甲状腺激素 ( 2）生殖激素(3）肾上腺/垂体激素 ( 4）贫血因子(5）肿瘤标记物 ( 6）感染性疾病(7）糖尿病 ( 8）心血管系统(9）病毒标记物 ( 10）骨代谢(11）过敏性疾病 (12）治疗药物监测三、试述分子印记技术的基本原理，步骤及其分类 1.原理： 当模板分子(印迹分子)与聚合物单体接触时会形成多重作用点，通过聚合过程这种作用就会被记忆下来，当模板分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子空间构型相匹配的具有多重作用点的空穴，这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性。 2.步骤：(1)在一定溶剂(也称致孔剂)中，模板分子(即印迹分子)与功能单体依靠官能团之间的共价或非共价作用形成主客体配合物 (2)加入交联剂，通过引发剂引发进行光或热聚合，使主客体配合物与交联剂通过自由基共聚合在模板分子周围形成高联的刚性聚合物 (3)将聚合物中的印迹分子洗脱或解离出来 ，这样在聚合物中便留下了与模板分子大小和形状相匹配的立体孔穴，同时孔穴中包含了精确排列的与模板分子官能团互补的由功能单体提供的功能基团，如果构建合适,这种分子印迹聚合物就象锁一样对此钥匙具有选择性。这便赋予该聚合物特异的“记忆”功能，即类似生物自然的识别系统，这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性。3.分类：目前,根据模板分子和聚合物单体之间形成多重作用点方式的不同，分子印迹技术可以分为两类：(1) 共价键法(预组装方式) 聚合前印迹分子与功能单体反应形成硼酸酯、西夫碱、亚胺、缩醛等衍生物，通过交联剂聚合产生高分子聚合物，用水解等方法除去印迹分子即得到共价结合型分子印迹聚合物 。该法已被应用于制备各种具有特异识别功能的聚合物，如糖类及其衍生物，甘油酸及其衍生物，氨基酸及其衍生物，芳基酮类，双醛类化合物，转铁蛋白和双辅酶等物质。但是，利用共价法在分子印迹过程中，模板分子和单体通过可逆的共价作用形成复合物。分子和单体间的作用力较强，形成的复合物很稳定，但过程复杂，模板分子需要被单体衍生化，而且模板分子的抽提也较困难。(2) 非共价键法(自组装方式) 非共价键法是制备分子印迹聚合物最有效且最常用的方法。这些非共价键包括静电引力(离子交换)、氢键、金属鳌合、电荷转移、疏水作用以及范德华力等。其中最重要的类型是离子作用，其次是氢键作用 非共价法由于利用超分子作用制备仿生模型，其分子识别类似于天然生物分子，非共价法的分子印迹系统具有多样性和普遍性，对印迹分子的类型没有太多限制，可使用多种功能单体，印迹分子可以用很简单的方法除去，因而发展很快。但专一性不如共价结合作用强。 分子印迹技术的分类 ：预组织法（共价法） Wulff 结合方式：可逆共价键 优点：空间精确固定排列 自组装法 （非共价法）Mosbach 结合方式：非共价键 优点：简单易行 模板容易除去 近似天然 牺牲空间法 （两者兼备）Vulfson 四、分析化学中常用的分离方法有哪些？其各有什么特点？ 沉淀分离法: 在样品溶液中加入沉淀剂,依据溶度积原理，通过沉淀反应，有选择地沉淀某些离子，而与其它离子分离开来的方法。特点：操作较繁琐且费时；分离选择性差溶剂萃取分离法: 在含有被分离物质的水溶液中，加入萃取剂和与水不相混溶的有机溶剂，震荡，利用物质在两相中的分配不同的性质，使一些组分进入有机相中，使另一些组分仍留在水相中，从而达到分离的目的。选择性好、回收率高、设备简单、操作方便、快速以及易于实现自动控制等特点离子交换分离法: 利用离子交换剂与溶液中的离子之间发生的交换反应进行分离的方法。1.分离效率高 能用于带相反电荷离子分离，又能用于带相同电荷及性质相近离子的分离2.应用广 即可用于分离，又用于富集，还可用高纯物制备及蛋白质、核酸、酶等生物活性物的纯化3.分离过程周期长、耗时多色谱分离法: 色谱是一种多级分离技术基于被分离物质分子在两相（一为固定相，一为流动相）中分配系数的微小差别进行分离。分离效率高。可分离性质十分相近的物质，可将含有上百种组分的复杂混合物进行分离。分离速度快。几分钟到几十分钟就能完成一次复杂物质的分离操作。灵敏度高。能检测含量在10-20克以下的物质。可进行大规模的纯物质制备定性能力较差挥发和蒸馏分离法:蒸馏可以分离出教纯净组分，分离出被测定组分，使其与共存物质分离，排除干扰。挥发可以通过测定放出的气体或剩余残渣的量进行痕量组分的分离或测定，也可以消除基体干扰。五、分析全过程的质量保证与质量控制包括哪些内容，实验的质量控制技术有哪些？ 采样的质量保证 包括:采样、样品处理、样品运输和样品储存的质量控制。 要确保采集的样品在空间与时间上具有合理性和代表性，符合真实情况。 采样过程质量保证最根本的是保证样品真实性，既满足时空要求，又保证样品在分析之前不发生物理化学性质的变化。 分析中的质量控制包括 ：样品的前处理、分析过程、室内复核、登记及填发报告等。n 技术：平行样分析n 加标回收分析n 密码加标样分析n 标准物比对分析n 方法对照分析n 室内互检及质量控制图 n六、简述液体样品取样方法及原理。 液体试样一般比较均匀，取样单元数可以较少； 当物料的量较大时，应从不同的位置和深度分别采样，混合均匀后作为分析试样，以保证它的代表性； 液体试样采样器多为塑料或玻璃瓶，一般情况下两者均可使用，但当要检测试样中的有机物时，宜选用玻璃器皿，而要测定试样中微量的金属元素时，则宜选用塑料取样器，以减少容器吸附和产生微量待测组分的影响。 液体试样的化学组成容易发生变化，应立即对其进行测试应采取适当保存措施，以防止或减少在存放期间试样的变化。保存措施有：控制溶液的pH值、加入化学稳定试剂、冷藏和冷冻、避光和密封等以减缓生物作用、水解、氧 化还原作用及减少组分的挥发。七、什么是超临界萃取，它的原理是什么？ 超临界流体萃取(Superitical Fluid Extraction，以下简称SFE)是一项发展很快、应用很广的实用性新技术。传统的提取物质中有效成份的方法，如水蒸汽蒸馏法、减压蒸馏法、溶剂萃取法等，其工艺复杂、产品纯度不高，而且易残留有害物质。超临界流体萃取是利用流体在超临界状态时具有密度大、粘度小、扩散系数大等优良的传质特性而成功开发的。它具有提取率高、产品纯度好、流程简单、能耗低等优点。 原理：超临界流体萃取:气-固萃取萃取剂: 超临界条件下的气体粘度低，接近零的表面张力，比很多液体容易渗透固体颗粒，易于除去。 超临界萃取的原理：超临界流体萃取分离过程的原理是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，超临界流体具有很好的流动性和渗透性，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。当然，对应各压力范围所得到的萃取物不可能是单一的，但可以控制条件得到最佳比例的混合成分，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的，所以在超临界流体萃取过程是由萃取和分离组合而成的。 八、.化学发光与荧光的区别，化学发光条件是什么？ 分子荧光是由于分子的外层电子在辐射能的照射下，吸收能量跃迁至激发态，再以无辐射弛豫