第三章 发酵培养基.ppt

第三章发酵培养基 培养基 广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料 同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件 发酵培养基的作用 满足菌体的生长促进产物的形成 发酵培养基 发酵培养基的要求 培养基能够满足产物最经济的合成 发酵后所形成的副产物尽可能的少 培养基的原料应因地制宜 价格低廉 且性能稳定 资源丰富 便于采购运输 适合大规模储藏 能保证生产上的供应 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求 如不应该影响通气 提取 纯化及废物处理等 发酵培养基 第一节培养基的类型及功能 培养基按其组成物质的纯度 状态 用途可分为三大类型 一 按纯度 合成培养基 原料其化学成分明确 稳定 适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律 培养基营养单一 价格较高 不适合用于大规模工业生产 天然培养基 采用天然原料 原料来源丰富 大多为农副产品 价格低廉 适于工业化生产 原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性 发酵培养基 二 按状态 固体培养基 适合于菌种和孢子的培养和保存 也广泛应用于有子实体的真菌类 如香菇 白木耳等的生产 半固体培养基 即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂 一般用量为0 5 0 8 主要用于微生物的鉴定 液体培养基 80 90 是水 其中配有可溶性的或不溶性的营养成分 是发酵工业大规模使用的培养基 三 按用途 从发酵生产应用考虑 培养基按其用途可分为孢子 斜面 培养基 种子培养基和发酵培养基三种 发酵培养基 第二节发酵培养基的成分及来源 一 碳源 1 作用 提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分 2 来源 糖类 油脂 有机酸 正烷烃 发酵培养基的成分及来源 3 工业上常用的糖类 葡萄糖 所有的微生物都能利用葡萄糖 工业上常用淀粉水解糖 但是糖液必须达到一定的质量指标 发酵培养基的成分及来源 不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大 发酵培养基的成分及来源 糖蜜 糖蜜是制糖生产时的结晶母液 它是制糖工业的副产物 糖蜜主要含有蔗糖 总糖可达50 75 一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜 发酵培养基的成分及来源 不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响 发酵培养基的成分及来源 糖蜜使用的注意点 除糖份外 含有较多的杂质 其中有些是有用的 但是许多都会对发酵产生不利的影响 需要进行预处理 例 谷氨酸发酵 有害物资 胶体成分 起泡 结晶 钙盐 结晶 生物素 发酵控制 预处理 澄清 脱钙 脱除生物素 发酵培养基的成分及来源 淀粉 糊精 使用条件 微生物必须能分泌水解淀粉 糊精的酶类 缺点 难利用发酵液比较稠 一般 2 0 时加入一定的a 淀粉酶成分比较复杂 有直链淀粉和支链淀粉等等 发酵培养基的成分及来源 例 地衣芽孢杆菌生产a 淀粉酶 碳源对生长和产酶的影响 碳源细胞量a 淀粉酶葡萄糖4 20蔗糖4 020糊精3 0638 2淀粉3 0940 2 发酵培养基的成分及来源 半纤维素酶 发酵培养基的成分及来源 嗜碱芽胞杆菌 AC 2 中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响 结果 各种碳源相差不大 推论 该菌种的碱性纤维素酶为组成型 发酵培养基的成分及来源 二 氮源 氮源主要用于构成菌体细胞物质 氨基酸 蛋白质 核酸等 和含氮代谢物 常用的氮源可分为两大类 有机氮源和无机氮源 1 无机氮源 种类 氨盐 硝酸盐和氨水 特点 微生物对它们的吸收快 所以也称迅速利用氮源 但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如 NH4 2SO4 2NH3 2H2SO4NaNO3 4H2 NH3 2H2O NaOH 发酵培养基的成分及来源 无机氮源被菌体作为氮源利用后 培养液中就留下了酸性或碱性物质 这种经微生物生理作用 代谢 后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质 如硫酸胺 若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质 如硝酸钠 正确使用生理酸碱性物质 对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用 选择合适的无机氮源有两层意义 满足菌体生长稳定和调节发酵过程中的pH 发酵培养基的成分及来源 毛霉产蛋白酶的研究 初始pH的影响 pH偏酸比较好 中性蛋白酶影响大 无机氮源的影响 硫酸铵 硝酸铵 硝酸钠 尿素 2 有机氮源 来源 工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料 花生饼粉 黄豆饼粉 棉子饼粉 玉米浆 玉米蛋白粉 蛋白胨 酵母粉 鱼粉 蚕蛹粉 尿素 废菌丝体和酒糟 成分复杂 除提供氮源外 有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子 例玉米浆 可溶性蛋白 生长因子 生物素 苯乙酸 较多的乳酸 硫 磷 微量元素等 发酵培养基的成分及来源 有机氮源成分复杂 可以从多个方面对发酵过程进行影响 而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性 所以在有机氮源选取时和使用过程中 必须考虑原料的波动对发酵的影响 氮源使用的一些相关问题 有机氮源和无机氮源应当混合使用 早期 容易利用易同化的氮源 无机氮源中期 菌体的代谢酶系已形成 则利用蛋白质 有些产物会受氮源的诱导和阻遏 例 蛋白酶的生产 有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力 开发效果好 有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣的课题 三 无机盐和微量元素 1 作用 磷 硫 铁 镁 钙 锌 钴 钾 钠 锰 氯等 其中许多金属离子对微生物生理活性的作用与其浓度有关 低浓度往往具有刺激作用 高浓度具有抑制作用 磷是构成核酸 蛋白质等细胞物质的组成成分 是许多辅酶和高能磷酸键的成分 氧化磷酸化的必需元素 铁是菌体的细胞色素 细胞色素氧化酶和过氧化物酶的组成元素 是菌体生命活动的必需元素之一 镁 锌 钴是某些酶的辅酶 钾影响细胞膜的通透性钠具有维持细胞渗透压的作用钙调节细胞的透性的作用 调节培养液中磷酸盐的含量 3 用量 根据具体的产品 以实验决定 例 铁离子青霉素发酵中 铁离子的浓度要小于20 g ml 4 使用注意 A 对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑 B 使用时注意盐的形式 pH的变化 例 黑曲酶NRRL 330 生产a 淀粉酶 pH对酶活的影响pH酶活不加4 25120分钟加K2HPO45 4530分钟加KH2PO44 6275分钟 2 来源 主要来自于C N源 以盐的形式补充 四 生长因子 前体和产物促进剂 从广义上讲 凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质 如氨基酸 嘌呤 嘧啶 维生素等均称生长因子 1 生长因子 如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型 以生物素为生长因子 生长因子对发酵的调控起到重要的作用 有机氮源是这些生长因子的重要来源 多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子 前体指某些化合物加入到发酵培养基中 能直接使微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去 而其自身的结构并没有多大变化 但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高 2 前体 青霉素 分子量356 苯乙酸 分子量136 作用 前体有助于提高产量 用量 前体的用量可以按分子量衡算 具体使用有个转化率的问题 例 6000单位 ml的青霉素G 需要多少苯乙酸青霉素 6000 0 6 微克 36mg ml苯乙酸 36 136 356 13 8mg ml 1 38 实际使用时的转化率在46 90 之间 发酵培养基 用法 前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性 浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸 一般基础料中仅仅添加0 07 前体相对价格较高 添加过多 容易引起挥发和氧化 流加也有利于提高前提的转化率 发酵培养基 3 产物促进剂所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物 又非前体 但加入后却能提高产量的添加剂 发酵培养基 促进剂提高产量的机制还不完全清楚 其原因是多方面的 有些促进剂本身是酶的诱导物 有些促进剂是表面活性剂 可改善细胞的透性 改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子 发酵培养基 五 水 是培养基的主要组成成分 既是构成菌体细胞的主要成分 又是一切营养物质的传递介质 对于发酵工厂来说 恒定的水源是至关重要的 因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大 水源质量的主要考虑参数包括pH值 溶解氧 可溶性固体 污染程度以及矿物质组成和含量 对于酿造行业 水的重要性不言而喻 对于常规发酵 要求可靠 持久地提供大量成分一致清洁的水 发酵培养基 第三节发酵培养基的设计和优化 目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方 只能用生物化学 细胞生物学 微生物学等的基本理论 参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方 再结合所用菌种和产品的特性 采用摇瓶 玻璃罐等小型发酵设备 按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基 发酵培养基 工业发酵培养基的设计 1为何要进行培养基的设计 完善的培养基设计是实验室的试验 实验工厂和生产规模的放大中的一个重要步骤 在发酵过程中 我们的目的产品是菌体或代谢产物 而发酵培养基是否适合于菌体的生长或积累代谢产物 对最终产品的得率具有非常大的影响 2培养基设计的基本原则培养基的组成必需满足细胞的生长和代谢产物所需的元素 并能提供生物合成和细胞维持活力所需要的能量 3如何进行培养基的设计 1 作出细胞生长和产物形成的化学计算的平衡碳源和能源 氮源 其他需要 细胞 产物 CO2 H2O 热量通过计算可以获得生产一定数量的细胞时所需的营养物的最低数量 在了解一定数量的生物体所能产生的产物数量后 就有可能计算出形成产物时所需的底物数量 2 组成微生物的元素包括C H O N S P Mg和K 见下表 这些元素都要在方程式中予以平衡在培养基中有些元素的含量往往超过需要量 如P和K 而其它元素含量则接近最低值 如Zn Cu等 在许多培养基中增加磷酸盐浓度 其用意是增加培养基的缓冲容量 这一点 在设计培养基时要引起注意 细菌 酵母和真菌的元素组成 按干重 计 3 有些微生物无力的合成特定营养物 如氨基酸 维生素或核苷酸 一旦测出其中一种是生长因子 就要在培养基中加入适量的纯净的化合物或含有该物质的混合物 4 碳源具有生物合成的底物和能源的双重作用 在需氧条件下 对碳源的需要量可以从菌体对底物的产率系数 Yx s 推算而得 一 培养基成分选择的原则 菌种的同化能力和速度 代谢的阻遏和诱导 合适的C N比 C N源比例直接影响微生物的生长和产物的积累 谷氨酸发酵 C N 4 1时 菌体大量生长 谷氨酸积累少 C N 3 1时 积累大量谷氨酸 菌体繁殖受抑制 pH的要求 发酵培养基 发酵产物在一定条件下是与细胞量呈正比 因此生产上多控制碳氮比以满足菌体的大量繁殖 同时又能大量合成产物 一 理论转化率与实际转化率 理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算 所得出的转化率的大小 实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小 如何使实际转化率接近于理论转化是发酵控制的一个目标 二 成分含量的确定 发酵培养基 二 实验设计 培养基成分的含量最终都是通过实验获得的 合理的实验方法 多因子实验 均匀设计 正交实验设计 响应面分析等 单因子实验 发酵培养基 当培养基成分确定后 剩下的问题就是各成分最适的浓度 由于培养基成分很多 为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法 三 培养基设计的步骤 根据前人的经验和一些必须考虑的因素 初步确定可能的培养基成分 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分 发酵培养基 类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化 郭秒 食品与工业发酵 2004 类胡萝卜素的作用 色素 营养保健 发酵培养基 原培养基 发酵培养基 初步确定可能的培养基成分 以碳源为例 发酵培养基 通过单因子实验确定适宜的培养基成分 以碳源为例 考虑到成本 乙酸钠是较为合适的碳源 进一步 乙酸钠的浓度2 比较好 发酵培养基 结果 碳源 乙酸钠0 2 氮源 氯化铵0 2 酵母膏0 03 无机盐 复合无机盐0 05 发酵培养基 正交设计确定优化的配方 发酵培养基 发酵培养基 改进后培养基 原培养基 改进后培养基的发酵结果 发酵培养基 四 摇瓶水平到反应器水平的优化配方 摇瓶 反应器培养基研究的两个层次 摇瓶 培养基设计的第一步 反应器 最终的优化的基础配方 发酵培养基 例 青霉素发酵 发酵摇瓶 玉米浆4 乳糖10 NH4 SO40 8 轻质碳酸钙1 发酵罐 葡萄糖流加控制总量10 15 玉米浆总量4 8 补加硫酸 前体等 摇瓶发酵培养基和罐的培养基差别很大 发酵培养基 摇瓶优化配方 菌种筛选 反应器研究的基础 发酵培养基 发酵罐 反应器水平 可以得出最终优化的基础配方 发酵培养基 pH控制摇床在1 3 丙二醇发酵中的应用 发酵培养基 1 3 丙二醇的用途 最重要的用途是作为单体与对苯二甲酸丙二醇聚合生产聚酯聚对苯二甲酸丙二醇酯 PTT 可作为增塑剂 洗涤剂 防腐剂和乳化剂等用于食品 化妆品和制药等工业 发酵培养基 PTT的性能 PTT最目前性能最好的纤维被誉为21世纪的大型纤维 发酵培养基 发酵培养基的设计和优化 1 3 丙二醇两步发酵法 糖 甘油 1 3 丙二醇 酵母 伯氏肺炎杆菌 丁酸梭菌等 发酵培养基 发酵培养基的设计和优化 伯氏肺炎杆菌1 3 丙二醇的代谢 甘油 三羟基丙醛 1 3 丙二醇 二羟丙酮 丙酮酸 乙酸乙醇乳酸丁醇丁酸丁二醇 2H H2O pH下降 厌氧过程 pH下降 2H 发酵培养基 发酵培养基的设计和优化 不同pH条件对甘油消耗的影响 发酵培养基 发酵培养基的设计和优化 摇瓶培养基分批培养过程结果 发酵培养基 发酵培养基的设计和优化 补料培养过程 甘油 浓度为3 43 对甘油转化率为19 发酵培养基 发酵培养基的设计和优化 1 3 丙二醇的浓度5 37 转