荧光分析法.ppt

15 00 30 第三章荧光分析法 一 荧光分析法发展概述二 分子的激发与去活化三 分子发光类型四 荧光的激发光谱和发射光谱五 荧光的寿命和量子产率六 荧光强度与溶液浓度的关系七荧光分析方法的特点 第一节荧光分析导论 FlourescenceSpectrmetry 15 00 30 一 荧光分析法发展概述 1 荧光当紫外光照射到某些物质的时候 这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光 而当紫外光停止照射时 这种光线也随之很快地消失 这种光线称为荧光 2 发展概况 15 00 30 二 分子的激发与去活化 1 分子的激发单重态分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的 即S O 该分子便处于单重态 大多数有机物分子的基态是处于单重态 激发单重态分子吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化 这时 分子处于激发单重态 用S表示 15 00 30 激发三重态电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的改变 这时分子具有两个自旋不配对的电子 称分子处于激发三重态用T表示2 激发分子的去活化辐射跃迁的去活化过程 发生光子的发射 伴随着荧光或燐光现象 15 00 30 非辐射跃迁的去活化过程 把激发能转变成振动能或转动能非辐射跃迁包括内转化 ic 和体系间窜跃 isc 内转化 internalconversion 过程指的是相同多重态的两个电子间的非辐射跃迁 体系间窜跃 intersystemcrossing 过程指的是不同过重态的两个电子生态间的非辐射跃迁 15 00 30 能级跃迁 1发生S1 S0的辐射跃迁而伴随荧光现象2发生S1 S0的内转化过程3发生S1 T1的体系间窜跃而处于T1态的最低振动能级的激发分子 则可能发生T1 S0的辐射跃迁而伴随燐光现象也可能发生T1 S0的体系间窜跃 15 00 30 三 分子发光类型 1 按激发模式光致发光 吸收光 化学发光或生物发光 化学能或生物能 热致发光 热 场致发光 电场和磁场 和摩檫发光2 按分子激发态的类型来划分荧光由第一电子激发单重态所产生的辐射跃迁而伴随的发光现象称为荧光燐光由最低的电子激发三重态所产生的辐射跃迁 其发光现象称为燐光 15 00 30 3 荧光的分类按时间分为 瞬时荧光和迟滞荧光按波长分类stokes荧光 溶液中观察到的荧光 通常称为stokes荧光 即荧光发射的光子能量低于激发光的光子能量 即荧光比激发光具有更长的波长 反stokes荧光 假如在吸收光子的过程中又附加热能给激发态分子 那么所发射的荧光波长可能比激发光的波长来得短 在高温的稀薄气体中可能观察到这种现象 15 00 30 共振荧光与激发光具有相同波长的荧光称为共振荧光4 瑞利散射光和拉曼射光瑞利散射光激发光的频率太低 其能量不足以使分子中的电子跃迁到电子激发态但可将电子激发至基态中转变的振动能级 假如电子在受激后能量没有损失 并且在瞬时返回原来的能级 于是便在各个不同的方向发射和激发光相同波长的辐射 这种辐射称为瑞利散射光拉曼光被激发到基态中其它转变振动能级的电子 当它返回到比原来的能级稍高或稍低时 便伴随着产生波长略长或略短于激发光波长的拉曼散射光 15 00 30 四 荧光的激发光谱和发射光谱 1 荧光的激发光谱定义 荧光的激发光谱简称激发光谱 它是通过测量荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱 它反映了不同波长激发光引起荧光的相对效率作用 鉴别荧光物质 选择适宜的激发波长 表观 激发光谱 2 荧光的发射光谱 荧光光谱 发射光谱 定义 使激发光的波长和强度保持不变 而让荧光物质所产生的荧光通过发射单色器 15 00 30 后照射于检测器上 扫描发射单色器并检测各种波长下相应的荧光强度 然后通过记录仪记录荧光强度对发射波长的关系曲线 所得到的谱图称为荧光光谱功能鉴别荧光物质在进行荧光测定时 可选择适宜的测定波长和滤光片 表现 荧光光谱荧光光谱特征在溶液荧光光谱中 所观察到的荧光的波长总是大于激发光的波长荧光发射光谱的形状与激发波长无关与吸收光谱的镜像关系 15 00 30 五 荧光的寿命和量子产率1 荧光寿命激发态返回基态之前耽搁在激发态的平均时间 1 kf K 经验 荧光寿命 10 8s燐光寿命 10 2s2 荧光量子产率荧光物质吸收光所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值 15 00 30 YF 发射的光子数 吸收的光子数YF kf kf K 荧光量子产率的数值 可以用参比法加以测定 测量结果按下式计算待测荧光物质的量子产率Yu YsFuAs FsAuYu Ys 分别表示待测物质和参比物质的荧光量子率Fu Fs分别表示待测物质和参比物质的积分荧光强度 15 00 30 Au As分别表示待测物质和参比物质的该激发波长的射光的吸光度 A bc 3 荧光量子产率和荧光寿命之间有如下关系YF 0内在的寿命 指没有非辐射去活化过程存在的情况下荧光分子的寿命 15 00 30 六 荧光强度与溶液浓度的关系 1 在稀溶液 bc 0 05 F 2 3YFI0 bcYF 荧光量子产率 摩尔吸光系数 I0 入射光强度 b 液池厚度 C 溶液中荧光物质的浓度2 在浓溶液中 15 00 30 七荧光分析方法的特点 1 特点 灵敏度高 选择性高 重现性好 取样量少 仪器设备不太复杂2 缺点 15 00 30 第二节荧光与结构的关系 一 有机物的荧光 1 具有大的共轭 键结构 2 具有刚性的平面结构 3 最低激发单重态S1为 型 4 取代基团为给电子取代基 15 00 30 1 共轭键体系 大部分荧光物质都有芳环 芳环越大 荧光峰越移向长波方向 荧光强度增大 这是由于芳环越大 共轭体系也越大 离域电子越容易激发 荧光越容易产生 同一共轭环数的芳族化合物 线性环结构者荧光波长比非线性者要强2刚性平面结构荧光效率高的荧光体 其分子多是平面构型且具有一定的刚性 15 00 30 试剂本身有刚性平面结构 形成络合物后 形成刚性平面 取代基之间形成氢键 异构体的影响3取代基的影响给电子取代基 加强荧光含这类基因的荧光体 其激发态常由环外的羟基或氨基的n电子激发转移到环上而产生的 由于它们的n电子的电子云几乎与芳环上的轨道成平行 因而实际上它们共享了 电子结构 15 00 30 同时扩大了其共轭双键体系 因此 这类化合物的吸收光谱与发射光谱的波长 都比未被取代的芳族化合物的波长长 荧光效率也提高了许多 取代基对苯荧光的影响 乙醇溶液 化合物荧光波长 nm 荧光相对强度苯270 31010苯酚285 36518苯胺310 40520苯基氰280 39020苯甲醚285 34520 15 00 30 得电子取代基这类取代基取代的荧光体 其荧光强度一般都会减弱 这类取代基也都含有n电子 然而其n电子的电子云并不与芳环上的 电子云共平面 不像给电子基因那样与芳环共享共轭键和扩大其共轭键 这类化合物的n 跃迁是属于禁戒跃迁 摩尔吸光系数很小 最低单线激发态S1为n 1 型 S1 T1体系间跨越强烈 因而荧光强度都很弱 而燐光强度相应增强 15 00 30 结论 不论给电子基因或得电子基因的取代 不仅影响到荧光体的荧光强度和波长 而且往往使荧光体的激发谱和发射谱中的精细振动结构丧失 取代基的位置邻位 对位取代者增强荧光 间位取代者抑制荧光重原子的取代4 最低单线激发态的性质最低单线激发态S1为 者其荧光强 15 00 30 不含杂原子 N O S等 的有机荧光体均属于这一类 最低单线电子激发态S1为 型 即 跃迁 它属于电子自旋允许的跃迁 摩尔吸光系数大约为104 比n 或n 型跃迁大百倍以上 荧光强度大 因荧光是吸光的逆过程 只有强吸收光才有可能发强荧光 15 00 30 第三节环境因素对荧光光谱和荧光强度的影响 一溶剂的影响同一种荧光体在不同的溶剂中 其荧光光谱的强度都可能有显著的差别溶剂的影响可以分为一般的溶剂效应和特殊的溶剂效应 前者指的是溶剂的折射率和介电常数的影响 后者指的是荧光体和溶剂分子的特殊化学作用 如氢键的生 15 00 30 成和配合作用 一般溶剂效应是普遍存在的 而特殊的溶剂效益则决定于溶剂和荧光体的化学结构 特殊的溶剂效应所引起荧光光谱的移动值 往往大于一般的溶剂效应所引起的 二 温度的影响温度对于溶液的荧光强度有着显著的影响 通常 随着温度的降低 荧光物质溶液的荧光量子产率和荧光强度将增大 15 00 30 三 PH的影响假如荧光物质是一种弱酸或弱碱 溶液的PH值改变将对荧光强度产生很大的影响 大多数含有酸性或碱性基因的芳族化合物的荧光光谱 对于溶剂的PH和氢键能力是非常敏感的 对于荧光性质而言 弱酸和弱碱的分子和离子可视为不同的型体 各具有自己特殊的荧光光谱和荧光量子产率 因而实验时要比较严格地控制溶液的PH 方能达到最好的灵敏度和准确度 15 00 30 四 氢键的影响荧光物质和溶剂或其它溶质之间发生的氢键作用 对于荧光物质的荧光光谱和荧光度有着显著的影响 1 分子间氢键的形成在激发之前基态的荧光物质分子便与溶剂或其它溶质分子产生氢键配合物 这种情况下 荧光物质的吸收光谱和荧光光谱都将由于与溶剂或其它溶质分子形成或氢键配合物而受到影响 15 00 30 在激发之后由激发态的荧光物质分子与溶剂或其它溶质分子产生的激发态的氢键配合物 由于只在激发之后才形成激发态的氢键配合物 因而只有荧光光谱才受到氢键作用的影响2 氢键对各类化合物的影响对氢杂环化合物的影响带取化基的芳环在氢键供体溶剂中 芳环上的供电子取代基上的孤对电子与芳环之间的激发态 15 00 30 电荷转移作用全部份地受到抑制 结果导致在这种溶剂中的电子光谱相对在烷烃中的光谱来说向短波方向移动 从芳环到吸电子取代基因的电荷转移作用却由于氢键供体溶剂的效应而增强 从而导致吸收光谱和荧光光谱相对在烷烃溶剂的情况下向长波发现移动氢键受体溶剂 有利于给电子取代基对芳环的共轭 吸收光谱向长波移动 不利于吸电子取代基对芳环的共轭 吸收光谱向短波移动 15 00 30 五 重原子效应1 外重原子效应2 内重原子效应六 表面活性剂的影响1 增溶2 增敏3 提高荧光量子产率4 提高5 增稳 15 00 30 七 散射光和拉曼光的影响在荧光分析中常常遇到溶剂的瑞利散射光 容皿表面的散射光 胶粒的散射光 丁铎尔效应 以及溶剂的拉曼光的干扰 前三种散射光的波长与激发光的波长一样 而拉曼光的波长一般比激发光的波长稍微长些 但它的频率与激发光的频率具有一定的差值 散射光和拉曼光对荧光分析有显著的影响 常常成为荧光分析方法灵敏度的主要限制因素 因而在实际工 15 00 30 作中对于它们的干扰需加以注意 采用荧光光度计时 只要选用适当的测定波长 便可排除或大大降低散射光或拉曼光的干扰 采用滤光片荧光计时 散射光和拉曼光常成为荧光空白的 致使荧光本底提高而降低方法的灵敏度和准确度 因而应仔细选择复合滤光片以涂去或降低散射光和拉曼光所造成的本底 如果荧光峰的波长与激发光的波长很靠近 则由散射光所引起的误差十分严重 15 00 30 可以调节荧光计的狭缝宽度以减弱散射光的强度 但同时也将降低荧光的强度 所以实际测定时需选择适当的狭缝宽度 15 00 30 第四节溶液荧光的猝灭 一 荧光猝灭作用1 定义 荧光猝灭指的是荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间发生的导致荧光强度下降的物理或化学作用过程 2 荧光猝灭剂 与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物质称为荧光猝灭剂 15 00 30 3 分类 动态猝灭动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间所发生的相互作用过程 如能量转移过程或电子转移过程 静态猝灭静态猝灭的特征是猝灭剂和荧光物质分子在基态时发生配合反应 15 00 30 在动态猝灭中 荧光的量子产率是光反应的动力学所控制 而在静态猝灭中 荧光的量子产率通常只受基态的配合作用的热力学所控制 4其它荧光猝灭剂 分子氧 胺类 是大多数未取代的芳烃的有效猝灭中 卤素化合物 对奎宁的荧光有显著的猝灭作用 15 00 30 重金属离子 硝基化合物二 碰撞猝灭动态猝灭 Stern Volmer方程式动态猝灭过程是与自发的发射过程相竞争从而缩短激发态分子寿命的过程 溶液中荧光物质分子M和猝灭剂分子及相互碰撞而引起荧光猝灭的最简单情况可表示如下 15 00 30 IaM h 1M 吸光过程 Ia速率kfM M h 荧光过程 kq1M Q M Q 猝灭过程 F0 F 1 ksv 0 Q 1 ksv Q 这一表示式称为Stern Volmer方程式F0 未加入猝灭剂时的荧光强度 15 00 30 F 加入给定浓度的猝灭剂时荧光强度 0 为没有猝灭剂存在下荧光分子的平均寿命ksv 猝灭常数 Ksv是双分子猝灭速率常数与单分子衰变速率常数的比率 它意味着这两种衰变途径之间的竞争 根据猝灭剂存在下荧光分子的平均寿命 与加入猝灭剂时荧光分子的平均寿命 0不同 我们可以得到方程式的另一种表现形式 15 00 30 0 1 kq 0 Q 1 ksv Q 三 组成化合物的猝灭某些荧光物质溶液在加入猝灭剂后荧光强度显著下降 且吸收光谱也发生明显变化 又如某些荧光物质溶液在猝灭剂后 其荧光强度随着温度的升高而增强 这些现象可能是由于荧光分子和猝灭剂之间形成不发荧光的基态配合物的结果 这种猝灭现象称为静态猝灭 15 00 30 荧光分子与猝灭剂之间生成的不发荧光的基态配合物 可以用下式表示M Q MQ配合物形成常数为 MQ K M Q 荧光分子与猝灭剂浓度之间的关系推导如下 M0 M MQ 15 00 30 F0 F F M0 M M MQ M 即F0 F 1 K Q 四 电荷转移猝灭五 能量转移猝灭1辐射能量转移2共振能量转移3交换能量转移4分子内的能量转移 15 00 30 六 光化学反应猝灭1光化学反应 由光激发的电子激发态分子所发生的化学反应 2光化学反应类型 3光解反应4光氧化或还原反应七 自猝灭1荧光辐射的自吸收 15 00 30 2荧光物质的激发态分子与基态分子M形成激发态的二聚体有的激发态二聚体并不发荧光 有的虽发荧光 但其发光特性与单体的发光特性不同 这就引起原来物质的荧光猝灭 3基态的荧光物质分子的缔合八 转让三重态的猝灭九