显微镜的概述.ppt

1 第二章光学显微镜 目的 认识光学显微镜的性能参数和掌握光学显微镜的基本结构 要求 一 了解光学显微镜 opticalmicroscope 的发展简史 二 熟悉光学显微镜的基本原理和性能参数 三 掌握光学显微镜的基本结构 2 1 光学显微镜有哪些光学参数 如何正确应用这些参数 2 什么叫数值孔径 放大率和分辨率 他们由哪些因素决定以及他们之间有何关系 3 透镜有几种像差 怎样产生的 如何消除 4 物镜与目镜在工作条件和技术要求上有些什么不同 如何正确使用 5 物镜上标有 10 0 25 160 0 17 请说明这些数字所表示的意义 3 6 可变光栏的作用是什么 7 显微镜的聚光镜与物镜的怎样进行搭配 8 显微镜照明系统的基本要求是什么 9 显微镜的照明方式分为几种 各有何特点 10 显微镜的光学系统有哪几部分组成 各起什么作用 4 光学显微镜 opticalmicroscope 简称光镜或显微镜 是一种将肉眼无法直接看清楚的微小物体进行光学放大成像的常用仪器 第一节光学显微镜概述 5 一 光学显微镜的发展简史 6 荷兰的眼镜商詹森 ZacchariasJanssen Janssen和他的显微镜 世界上最早的一台显微镜 显微镜的发展历史 16世纪 6 7 MarcelloMalpighi通过显微镜为血液循环理论提供了证据RobertHook改进了显微镜 并发现了细胞 显微镜的发展历史 17世纪 RobertHooke和他的显微镜 7 8 Hooke观察到的软木片的细胞结构 Hooke显微镜下的跳蚤 8 9 荷兰人安东尼 冯 列文虎克 AnthonyVonLeeuwenhoek 列文虎克的显微镜 显微镜的发展历史 17世纪 9 10 现代的光学显微镜 显微镜的发展历史 18 19世纪 10 11 根据不同的使用用途 光学显微镜可分为 普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜荧光显微镜倒置显微镜体视显微镜偏光显微镜等10多种 12 普通的光学显微镜是由两组透镜所组成 左边小的透镜代表一组焦距很短的透镜组 称为物镜 右边一组焦距较长的透镜组称为目镜 其成像原理如图所示 二 显微镜的光学原理 13 显微镜的成像原理图 经物镜 目镜放大后得到放大的倒立的虚像 14 Inthecompoundmicroscope theobjectiveformsareal invertedimageattheeyepiecefrontfocalplane theprimaryimageplane 15 二 显微镜的光学原理 将被观察的物体AB置于物镜前的物方焦点F1稍外的地方 物体AB发出的光线经物镜O1放大后成一倒立实像A B 于目镜前焦点附近 16 再经目镜O2放大后 我们就可以获得一个经两次放大的倒立虚像A B 该虚像呈现在观察者的明视距离处 17 三 显微镜的性能参数 一 数值孔径 二 分辨率 三 放大率 四 视野 视场 五 景深 焦点深度 六 工作距离 七 镜象亮度 八 清晰度 18 一 数值孔径 数值孔径 numericalaperture 的概念 又叫做镜口率 简写为N A 表示物镜吸光本领的大小 常用物体与物镜间介质的折射率n与物镜镜口角的一半 2 的正弦值的乘积来表示 如图所示 数值孔径的数学表达式 N A n sin 2 19 镜口角的概念 被观察点射入物镜边缘光线间的夹角是一个圆锥角叫镜口角 2 物镜的镜口角 镜片 20 镜口角 的大小能说明什么 镜口角的大小能说明进入物镜光量的多少 镜口角越大进入的光量越多 此物镜的聚光本领越强 物像的量度越大 物像就更清楚 明显 21 数值孔径的意义 数值孔径是衡量显微镜性能的极为重要的一个技术参数 它决定或影响着显微镜的其它性能参数 1 它与放大率成正比 与景深成反比 2 它的平方与图像亮度成正比 3 数值孔径越大 其视场和工作距离则越小 22 提高数值孔径的方法 N A n sin 2一 增大镜口角 二 增大物镜与标本之间介质的折射率n 23 数值孔径增大的程度 采取增大镜口角 方法时 可以让标本与物镜尽量靠近 采取增大折射率n方法时 24 例如 设 111012 当物镜与标本之间以空气为介质时 数值孔径 N A n sin 2 1 sin111012 2 0 83 25 当物镜与标本之间以香柏油为介质时 数值孔径 N A n sin 2 1 515 sin111012 2 1 25可见 在 相同的情况下 加入香柏油以后 可使数值孔径由0 83提高到1 25 目前 在实用范围内 油镜所能达到的最大数值孔径为1 4 26 二 分辨率 分辨率的概念 又称鉴别率或分辨本领 是指显微镜分辨被检物体的微细结构的能力 分辨距离的概念 是指能被分辨开的两物点间的最小距离 27 衍射斑的概念 根据光的衍射理论 点光源放出的光波经透镜会聚后并不是一个理想的清晰的亮点 而是一个中央亮 外面依次是暗明相间的环 称作衍射斑 28 瑞利条件 根据光的衍射理论 两个相邻的点光源能够经光学折射系统被分辨开来的必要条件是每一个衍射斑的中央亮圆中心落在另一个衍射斑的第一暗环上 瑞利以此作为光学系统的分辨极限 称为瑞利条件 29 AiryDiskFormationbyFiniteObjectiveAperture Thewidthofcentralmaximumprop to andinverslyprop toobjectiveaperature 30 30 光学显微镜的分辨本领 31 分辨率与分辨距离的关系 它与 分辨距离 成反比 分辨距离越小 显微镜的分辨率越高 如果两物点间的距离小于分辨距离 就会把两点看成一点 也就不能看清它的结构 显微镜的分辨率是由物镜来决定的 目镜只起 放大镜 的作用 并不提高显微镜的分辨率 32 物镜的分辨距离的数学表达式 在普通中心照明的情况下 物镜的分辨距离由下式决定 d 2N A 式中d表示分辨距离 入表示照明光线的波长 33 用可见光照明的普通显微镜 分辨距离的极限是多少 在可见光中亮度最大而且对人眼最敏感的波长为0 55um 物镜最大的N A 为1 4 代入公式 d 2N A 可得 d 0 55 2X1 4 0 2um 即利用可见光的普通显微镜 在中心照明的情况下 分辨距离的极限为0 2um 34 提高物镜的分辨率的方法 分辨距离公式 d 2N A 1 提高物镜的数值孔径N A 2 使用波长较短的照明光线 35 利用紫外线作为光源的分辨距离与可见光的比较 紫外线的波长比可见光短 约为0 27um 可见光波长为0 55um 利用紫外线作为光源的紫外显微镜 分辨距离公式 d 2N A进行计算 其分辨率高于可见光一倍 分辨距离可达0 1um 但因为眼睛看不见紫外线 只有拍成照片以后再观察 比紫外线的波长更短的还有x射线 射线等 但目前没有发现可用的透镜材料 36 37 三 放大率 显微镜的放大率的概念 指物体经物镜 目镜两次成像后眼睛所能看到像的大小与原物体大小的比值 即是物镜的单向放大率m和目镜的角放大率 的乘积 38 显微镜的放大率数学表达式 M m L f物 250 f目式中M表示显微镜的总放大率 L f物表示物镜的放大率 250 f目表示目镜的放大率 L表示显微镜的光学筒长 f物表示物镜的焦距 f目表示目镜的焦距 250 毫米 表示明视距离 39 为什么显微镜的放大率不能无限的增大 1 M m L f物 250 f目从公式可知 物镜和目镜的焦距愈短 光学筒长愈长 总放大率愈大 但焦距太短或镜筒过长 都会造成工作不方便 因此 显微镜的放大率不能无限的增大 2 显微镜的放大率是受分辨率制约的 如果标本的细节不能分开来 过度的放大 毫无意义 40 显微镜将标本的细节分辨清的条件 要看清标本的细节 必须同时满足两个条件 1 物镜有足够的分辨率 以保证像不互相重叠 d 2N A 2 显微镜有足够的放大率 以保证像在眼中所张的视角大于1分 小于1分时眼睛看不见 这两个条件缺一不可 否则就看不清或看不见像的细节 41 显微镜最合适的总放大率 显微镜最合适的总放大率 称为有效放大率 用M有效表示 是在物镜数值孔径的500 1000倍之间 即500N A M有效 1000N A 在有效放大率范围内 眼睛可以长时间观察而不易疲劳 如果总放大率低于500N A 观察起来很吃力 反之 如果高于1000N A 则会使像质变坏 甚至造成不真实的像 42 标本的细节首先必须由物镜分辨开来 然后再把它放大到适合眼睛观察的程度就可以了 实验证明 对眼睛来说视角放大到2分 4分之间最合适 眼睛可以长时间观察而不易疲劳 视角是指眼睛里水晶体中心至被观察的物象两端点的连线之间的夹角 如图所示 视角 A B AB放大后的物象 43 现将视角 为2分 0 00058弧度 时的情况如下 设显微镜的总放大率M 则放大后两细节间的距离为Md 而且成象在明视距离250mm处 如图所示 250mm 2分 Md 假定两细节间的距离为d 把视角放大到2分与4分之间时 显微镜的最合适的总有效放大率为多少 44 则有 tan Md 250 因 很小时 tan 或 0 00058 Md 250将公式d 2N A 代入上式 并取 0 55um 0 55x10 3mm 整理后可得 M 527N A 500N A 用同样的方法可以计算 当视角为4分时M 1000N A Md 250mm 45 四 视野 视场 视野的概念 又称视场 field 是指显微镜一次所能看到被检标本的范围 视野宽度 由于它由目镜的视场光阑局限成圆形 则把该圆形视野的直径称为视野宽度d 46 视野宽度与视野的关系 d取决于物镜的放大倍数及目镜的光阑大小 小放大倍数和大光阑可获得较大的视野 当视野中不能容放整个标本时 要通过机械装置移动标本进行分区或连续移动观察 47 视野 视场 与放大率的关系 视野的大小与显微镜的总放大率成反比 总放大率愈大 视野越小 48 五 景深 焦点深度 depthoffield 景深又称焦点深度 focaldepth 是指当显微镜调焦于某一物平面 对准平面 时 位于对准平面前后二侧的二个仍能清楚观察的平面间的距离 不仅这一物平面可以看清楚 而且和它相连的上下物平面也同时看清楚 这上下两物平面之间的距离叫做焦点深度 49 显微镜的数值孔径愈大 景深愈小 总放率愈大 景深愈小 例如 使用N A 为1 25 100 x的油镜 配以12 5x的目镜观察时 景深只有0 27um 调焦后一次只能看清楚0 27um厚的一个薄层 显微镜的景深与其它参数的关系 50 六 工作距离 工作距离是指显微镜调焦后 在使用标准盖波片和标准机械筒长的情况下 物镜前透镜的下表面至盖波片上表面之间的距离 从物镜前表面中心到被观察标本之间满足工作要求的距离范围 51 物镜与工作距离的关系 物镜的放大倍数愈高 工作距离愈短 一般 10 x 以下的低倍物镜 工作距离为5 7mm 40 x 的高倍物镜 工作距离为0 5mm左右 100 x 的油镜 工作距离只有0 19m