残留消毒剂的去除方法(原).doc

残留消毒剂的去除方法按照对微生物的作用，可将消毒剂分为三种类型：一是兼有杀菌和抑菌作用的消毒剂。大多数常用消毒剂为这种类型，高浓度时表现为杀菌作用，低浓度时表现为抑菌作用。二是只有杀菌作用的消毒剂，例如乙醇等。三是只有抑菌作用的“消毒剂”。有些消毒剂对某些微生物表现为强大的杀菌作用，但对另一些微生物却只有抑菌作用，例如新洁尔灭，对繁殖体型细菌是杀菌的，但对细菌芽胞却只有抑菌作用。然而，如果一种化合物对各种微生物都只有抑制作用而无杀灭作用，则不能用作消毒剂。因为对消毒剂的要求是杀灭或消除外环境中的微生物，这与体内抗菌作用是不同的。对于后者来说，即使是一种只有抑菌作用的药物， 也可能成为一种良好的抗菌剂，因它可能与机体的免疫因素相协同。消毒试验的中心问题，是评价消毒因子的杀菌和抑菌作用。评价化学消毒剂的作用，必须严格掌握作用时间。消毒剂和微生物接触到预定的时间之后，必须立即解除其作用，这样才能准确地获得消毒剂作用强度的数据，同时，在采取的消毒后样本中必须不含有残余的消毒剂，以防止在恢复培养(Subculture)中微生物继续受到消毒剂的作用。因此，任何一个评价化学消毒剂的实验，都必须有可靠的去除残余消毒剂的方法。不采用去除残余消毒剂措施的实验，应认为是在设计上的严重失误，依据这样的试验得出的结论是不可靠的。去除残余消毒剂的方法很多，现将几种常用的方法介绍如下。(一)化学中和法是目前最常用的去除残余消毒剂的方法，其优点是方法简单、使用方便，效果可靠。 一种消毒剂能用什么化合物中和，需要经过严格的筛选，并确定其使用浓度。一般来说，用作中和剂的化合物(单方或复方)应具有下述特点：对相应的消毒剂具有切实可靠的中和作用，中和剂本身或与消毒剂反应的产物对实验微生物无杀灭或抑制其生长的作用，对培养成份无破坏作用，亦不影响其物理性状。随着消毒剂研究的进展，国内外对中和剂的研究也在不断的发展中。目前常用的消毒剂及其相应的中和剂详见表16。筛选中和剂的实验方法不太复杂，现将顾德鸿教授等(1982)推荐的实验方法介绍如下。试验前先准备下列4支试管：(甲)含中和剂的稀释液9mi加使用浓度的消毒剂lml；(乙)含中和剂的稀释液9mi加灭菌蒸馏水lml；(丙)灭菌蒸馏水10ml；(丁)试验菌的过夜培养物。用灭菌蒸馏水稀释至约10，000个菌m1，用时掐匀。试验的方法步骤如下：(1)在甲，乙、丙3支试管内分别接种稀释后的细菌培养物(丁)lml；(2)接种后立即用50滴m1滴管分别吸取甲，乙、丙管中的混合液，在1个分为3区的营养琼脂平板上于每个区内各滴5滴；(3)于接种后30分钟和60分钟，再以(2)的方法取样，各滴1块琼脂平板；(4)将上述3块琼脂平板放温箱内培养(培养温度根据试验的菌种而定)，24小时后观察并记录结果。可能获得的结果有4种类型(表18)。表16 常用消毒剂的中和剂及其使用浓度消 毒 剂中 和 剂 及 其 使 用 浓 度甲醛戊二醛乙型丙内酯过氧乙酸台氯消毒剂季铵盐类治毒剂碘(溴)制剂酚类消毒剂洗必太汞制剂醇类脂类酸类碱类吖啶类亚硫酸钠，0105双甲酮(0.11.0)+吗啉(0.61.0)氨水亚硫酸钠(0.10.5)双甲酮(0.11.0)+吗啉(0.61.0)甘氨酸(1.0)，赖氨酸硫代硫酸钠(0.10.5)硫代硫酸钠(0.10.5)硫代硫酸钠(0.11.0)；LpHT；LpwT；吐温80(0.53.0)硫代硫酸钠(0.10.5)亚硫酸钠(0.10.5)罗日磷月旨(0.3)Letheen琼脂，Letheen肉汤亚硫酸钠(0.10.5)，卵磷qS(0.10.3)硫代硫酸钠(0.1)，LpHT；LpT；牢胱氨酸(0.1)吐温-80(110)卵磷脂(0.10.3)；Lp；LpHT；LpwT；Lwl；Lw2；Lws卵磷脂(1.02.0)硫代硫酸钠，亚硫酸纳；LpHT；LPC；牛胱氨酸(0.1)，组氨酸(0.1)吐温80吐温80(5.010.0)碱类 酸类硫代硫酸钠等注：表1S中包括了许多复方中和剂，这些中和剂的配方详见表17。 表17 一些复方中和剂的配方中 和 剂组 成 成 分 及 含 量()LPLPCLPHlLPH2LPHTLPELPTLpwTLPWLwlLw2卵磷脂(0.3)，吐温-80(3.0)卵磷脂(0.3)，吐温-80(3.0)，牢胱氨酸(0.1)卵磷脂(0.3)，吐温-80(3.0)，组氨酸(0.1)卵磷脂(0.3)、吐温-80(1.0)，组氨酸(0.1)卵磷脂(0.3)、吐温-80(3.0)、组氨酸(0.1)，硫代硫酸纳(0.5)卵磷脂(0.3)、吐温-80(3.0)、日硅硫酸钠(0.4)卵磷脂(2.0)、吐温-80(2.0)，硫代硫酸纳(0.5)卵磷脂(0.5)、吐温-80(1.0)，I,ubrol W(1.0)硫代硫酸纳(1.0)卵磷脂(2.0)，吐温-80(4.0)，Lubrol W(7.0)卵磷脂(0.3)，Lubrol W(1.0)卵磷脂(2.0)，Lubrol W(3.0)续表 泊 毒 剂中 和 剂 及 其 使 用 浓 度Lw3PHPHCLetheen肉汤Letheen琼脂罗g磷n旨(4.0)、Lubrol W(4.0)吐温80(1.0)、组氨酸(1.0) 吐温80(1.0)、组氨酸(1.0)，牢胱氨酸(0.1)卵磷脂(0.1)、 1-80(0.1)、肉汤 卵磷脂(0.1)、吐温-80(0.1)琼脂 表10 中和剂试验的4种类型结果结果类型作用时间(分)生 长 菌 落 数结 论中和剂+消毒剂中和剂+水水W03060322531442739393632满 意K03060124172817980847l不满意Y03060506360320697466不满意Z03080000563959973不满意从表18中可以看出，在W类型，3个时间取样接种的平板上3个区内生长的菌落数非常 接近，这是满意的结果。说明它能有效地中和消毒剂的制菌能力，而它本身并不阻碍细菌的 生长。一般来说，如果3区中有2区的菌落数不超过另1区的10倍，即可认为是满意的结果。x类型的结果说明，“中和剂”未能中和消毒剂的制菌作用，而它本身也不影响细菌的生长。Y型结果说明，试验的中和剂虽能中和消毒剂的杀(抑)菌作用，但它本身对细菌也有 毒性。2型结果说明，试验的中和剂不仅没有中和消毒剂制菌作用的能力，而且它本身也能 抑制或采灭细菌。因此，X、Y，Z类型的试验结果均为不理想的，说明试验的“中和剂”均不能用作该消毒剂的中和剂。上述试验可以指导我们选择合适的中和剂。但应指出，消毒剂的浓度和中和剂的浓度必须合适，中和剂浓度过低和过高均可影响实验结果的准确性，在消毒试验中必须注意选用合适的中和剂浓度。从上述试验的原理可以看出，这种试验不仅可以用来选择合适的中和剂，而且在试验项目的安排上稍作改进之后，也可以用来研究同一中和剂的不同浓度对消毒剂的 中和作用及其本身或其与消毒剂反应的产物对试验微生物的毒性。当然，研究中和剂的合适浓度还有其他实验方法。Cheung等(1981)用下述方法评价了甘氨酸(Glyeine)对2碱性戊二醛的中和作用。试验菌株为脂肪嗜热杆菌芽胞(月stearothermophilus)NCTCl0000。先将菌株培养于500ml化学限量培养基(Chemically Detined Meadia，CDM)内。这种培养基糖含量少，限制了菌株的指数生长，糖耗竭之后则形成芽胞。于60U下培养60小时之后，收获芽胞，制成108m1悬液。然后用于甘氨酸对2碱性戊二醛灭活作用的试验。试验方法如下：(1)加入芽胞之前用甘氨醛灭活戊二醛：在加入芽胞之前20分钟，于2碱性戊二醛溶液内加入木同浓度的甘氨酸，所用甘氨酸浓度有4种；4、2、1和05；并设不加甘氨酸的对照。加入芽胞后于2。5， 5、75小时分别采取样本，各涂布5只平皿，于60C下培养24小时，计数菌落。以5个平皿生长菌落的均数代表该时间的存活菌数。研究结果发现，经用2或4甘氨酸对2碱性戊二醛中和20分钟后再接种脂肪嗜热杆菌芽胞，则经L57.5小时作用后菌数无减少，说明2和4甘氨酸可灭活2碱性戊二醛。用1和0.5书氨酸中和2碱性戊二醛后，存留菌数介于对照和2及4甘氨酸组之间，说明对消毒剂的灭活不完全。 (2)加入芽胞以后用甘氨酸灭活戊二醛，先用2.6戊二醛对芽胞处理30分钟，然后加入不同浓度的甘氨酸(0.5、1.0、2.0，1.0)中和，并设不加中和剂的对照。于加人中和剂后20分钟和8小时，采样计数存活菌数，以比较不同浓度甘氨酸对2 96碱性戊二醛的灭活作用。结果也证明，低于2的甘氨酸不足以完全灭活2碱性戊二醛，用1甘氨酸对2碱性戊二醛也有灭活作用，但作用强度仅为2或4甘氨酸的一半。 (二)吸附法是采用血清、明胶，脱脂牛奶、牛胆汁，去纤维羊血、卵磷脂、硬脂酸盐等吸附剂，去除残余消毒剂。适用于找不到合适化学中和剂的消毒剂。一般吸附剂可直接加入液体或固体培养基内，最高浓度可达10。一种消毒剂用什么吸附剂，需要经过筛选试验来确定。选扦吸附剂的试验方法类似于选择化学中和剂的试验。试验应分下述几组： (1)(消球剂+菌液)+吸附剂：观祭吸附剂刘消毒剂有无吸附作用，(2)吸附剂+菌液：观察吸附剂有无杀(抑)菌作用；(3)(消毒剂11及附剂)十菌液：观察消毒剂和吸附剂的产物有无制菌作用；(4)培养基+菌液：观察培养基是否适合试验菌生长，(5)消毒剂十菌液：观祭试验浓度的消毒剂有无制菌作用；(6)空白培养基对照，观察培养基有无污染。(三)稀释法方法是将消毒后样本接种子大量培养基内，或经过连续稀释之后再接种，使残留消毒剂的浓度降低到不足以抑制细菌生长的水平。例如，可取0.5ml消毒后的茵药混合液或1个试验菌片，接种于100200mi肉汤培养基内，振荡后培养。也可将消毒后的菌药混合液或试验菌片的洗液，经10-110-4稀释后，再接种培养基。用稀释法时应注意设未消霉的样本村照、消毒后样本常量培养对照和空白培养基对照。(四)连续接种法 取消毒后样本接种于肉汤培养后若无菌生长再转种人新鲜肉汤，每天转种1次，共7天，仍无菌生长者可认为消毒剂具有杀菌作用。(五)离心沉淀法取消毒后样本3ml，3，000转分，离心沉淀5分钟，水洗，共离心23次，取沉渣接种培养。同时设原菌液沉淀物对照未经离心的消毒后样本对照及空白培养基对照。(六)过滤法：取消毒后样本5l0ml，用薄膜滤器抽滤。因滤膜孔径很小，细菌不能通过，抽滤后细菌停留在滤膜上。再用灭菌蒸馏水2030ml冲洗滤膜上的细菌，并再次抽滤以去除残留消毒剂，最后将滤膜置于琼脂平板培养。试验时应设原菌液抽滤对照(注意控制菌量)，未经抽滤的消毒后样本直接培养对照和空白培养基对照。(七)水洗法 用于载体试验中残余消毒剂的去除，消毒后的试验菌片在接种于培养基之前先用灭菌水 洗，以除去残留在菌片上的消毒剂，然后再接种。方法是：将消毒后的菌片放人含有5ml无 菌水的试管内，振动数次后放置12分钟，再取出菌片，