微生物方法学验证范本.doc

11/12编码：VP-C01-MM-01XXXX软膏微生物限度检查方法学验证方案起草人： 年 月 日 审核人： 年 月 日 年 月 日 年 月 日 批准人： 年 月 日目 录1.验证立项表2.验证内容2.1验证目的2.2验证范围2.3 验证要求2.4 验证方法2.4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物2.4.2细菌、霉菌及酵母菌验证内容2.4.3 金黄色葡萄球菌验证内容2.4.4铜绿假单胞菌验证内容3. 验证报告验证立项表（REC） 立项题目立项部门申请人申请日期要求完成日期验证类别负责部门参与部门及人员验证原因质量部审核意见 审核人： 日期：验证领导小组审批意见审批人： 日期：备注XXXX软膏微生物限度检查方法学验证方案编码：VP-C01-MM-01品 名验证依据2005版药典规 格验证日期 年 月 日数 量报告日期 年 月 日 验证项目细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌1.验证目的 XXXX软膏配方中含水杨酸、硼酸，该两种物质具有一定的抑菌性。根据中国药典（2005年版）微生物限度检查标准规定，对XXXX软膏进行细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查方法的验证试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。2.验证范围 本公司XXXX软膏的微生物限度检测。3.判定标准 3.1验证小组成员姓名职务职责组长负责验证方案、报告的批准项目负责人负责验证方案、报告的起草与具体实施验证小组成员负责验证试验及填写记录3.2细菌、霉菌及酵母菌 在3次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%；产品的试验组与阳性菌组的菌落数差异不超过30%，假定产品试验组的平均值与阳性菌组的平均值之比为Q，则0.7Q1.3。3.3金黄色葡萄球菌 在3次平行试验中， 供试品组：结果应为阴性，未检出金黄色葡萄球菌；试验组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。3.4铜绿假单胞菌 在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出铜绿假单胞菌；试验组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。 4.验证方法4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物4.1.1试验样品：XXXX软膏三批，批号为 、 、 。4.1.2稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。配法：照（05版药典附录XIII C）配制；0.9%无菌氯化钠溶液的配制：取氯化钠9.0g，加1000ml使完全溶解，分装，灭菌。4.1.3实验仪器：无菌培养皿（直径9.0cm）、净化室、灭菌锅、无菌刻度吸管（10ml、1ml）,水浴锅，试管（18180）,具塞三角瓶。4.1.4验证用培养基 营养琼脂培养基 、甘露醇氯化钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、溴化十六烷基三甲铵培养基、玫瑰红钠培养基。 4.1.5验证用微生物名称及编号 菌珠名称传代次数大肠埃希菌MCC(B)44102金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501白色念珠菌霉CMCC(F)980014.1.6菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中培养1824小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养2448小时；上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液。4.1.7供试品溶液的制备 称取XXXX软膏10g，置灭菌三角瓶中，加入PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，45下使之全部溶化，摇匀，作为1：10的供试品溶液。4.2细菌、霉菌及酵母菌验证内容4.2.1试验组：分别取1:10供试品溶液0.2ml注入两个平皿，接种50-100个挑战微生物，每株试验菌平两行制备两个平皿（分别注入以上四种菌悬液），向平皿内倒冷却至45的营养琼脂培养基（细菌）或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（白色念珠菌霉）1520ml：并混合均匀凝固后，置于所需温度下培养。4.2. 2菌液组：不加供试液，直接将试验菌株接种于2个平皿中，其余操作步骤同样品试验组操作。4.2.3供试品对照组：取1:10供试品溶液0.2ml分别注入两个平皿，向平皿内倒冷却到45的营养琼脂培养基（细菌）或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（白色念珠菌霉）1520ml,并混合均匀凝固后，置于所需温度下培养。4.2.4上述操作，应做三次平行试验，分别计算各次试验的菌的回收率。试验组的菌回收率=(试验组平均菌落数供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数100%。4.2.5培养：营养琼脂培养基平皿倒置于30-35下培养48h，玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基倒置于23-27下培养72h。4.2.6观察和计数：对每个平皿逐日检查计数，结果以培养终至的计数为准，并将每组试验中接有相同试验菌株的两个平皿计数进行平均，取平均值。观察微生物的菌落形态并做革兰氏染色，以确认生长菌与接入的微生物相同。4.2.7验证用微生物的稀释度和接种量 菌珠名称浓度（CFU）/ml稀释度接种量大肠埃希菌约50-100cfu10-60.1ml金黄色葡萄球菌约50-100cfu10-60.1ml枯草芽孢杆菌约50-100cfu10-50.3ml白色念珠菌霉约50-100cfu10-40.1ml4.2.8试验结果 4.2.8.1品名： 批号： （供试品注入量:每皿注入0.2ml） 菌珠名称试验组菌液组供试品对照组试验组菌回收率%碟1碟2平均碟1碟2平均碟1碟2平均大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌验证结果： 复核人： 检验人：4.2.8.2品名： 批号： （供试品注入量:每皿注入0.2ml） 菌珠名称试验组菌液组供试品对照组试验组菌回收率%碟1碟2平均碟1碟2平均碟1碟2平均大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌验证结果：复核人： 检验人：4.2.8.3品名： 批号： （供试品注入量:每皿注入0.2ml） 菌珠名称试验组菌液组供试品对照组试验组菌回收率%碟1碟2平均碟1碟2平均碟1碟2平均大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌验证结果：复核人： 检验人：4.3铜绿假单胞菌验证内容4.3.1供试品组 取1：10的供试品液10ml加入100ml无菌胆盐乳糖培养基中，35-37培养24小时后取培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，培养24小时，按中国药典2005版二部附录XJ微生物限度检查法中控制菌检查项下（铜绿假单胞菌）进行检查，结果应为阴性，未检出铜绿假单胞菌。4.3.2试验组 取1：10的供试品液10ml加入100ml无菌胆盐乳糖培养基中，加入铜绿假单胞菌对照菌液1ml，35-37培养24小时后取培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，培养24小时，其余同供试品组。结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。4.3.3阴性对照菌组 取1：10的供试品液10ml加入100ml无菌胆盐乳糖培养基中，加入大肠埃希菌菌液1ml, 35-37培养24小时后取培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，培养24小时，其余同供试品组。结果应为阴性，未检出大肠埃希菌。4.3.4阳性对照菌组 取铜绿假单胞菌对照菌液1ml加入100ml无菌胆盐乳糖培养基中，35-37培养24小时后取培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，培养24小时，其余同供试品组。结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。4.3.5验证结果 4.3.5.1品名： 批号： 试验组 阴性对照组供试品组阳性对照组溴化十六烷基三甲铵革兰氏染色氧化酶试验单项结论验证结果：复核人： 检验人：4.3.5.2品名： 批号： 试验组阴性对照组供试品组阳性对照组溴化十六烷基三甲铵革兰氏染色氧化酶试验单项结论验证结果：复核人： 检验人：4.3.5.3品名： 批号： 试验组阴性对照组供试品组阳性对照菌组溴化十六烷基三甲铵革兰氏染色氧化酶试验单项结论验证结果：复核人： 检验人：4.4金黄色葡萄球菌验证内容4.4.1供试品组供试品组 取1：10的供试品液10ml加入100ml无菌营养肉汤培养基中，35-37培养24小时后取培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，培养2472小时，按中国药典2005版二部附录XJ微生物限度检查法中控制菌检查项下（金黄色葡萄球菌）进行检查，结果应为阴性，未检出金黄色葡萄球菌。4.4.2试验组 取1：10的供试品液10ml加入100ml无菌营养肉汤培养基中，加入金黄色葡萄球菌对照菌液1ml，35-37培养24小时后取培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，培养2472小时，其余同供试品组。结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。4.4.3阴性对照组 取1：10的供试品液10ml加入100ml无菌营养肉汤培养基中，加入大肠埃希菌对照菌液1ml，35-37培养24小时后取培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，培养2472小时，其余同供试品组。结果应为阴性，未检出大肠埃希菌。4.4.4阳性对照菌组 取金黄色葡萄球菌对照菌液1ml加入100ml无菌营养肉汤培养基中，35-37培养24小时后取培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，培养2472小时，其余同供试品组。结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。4.4.5检验结果4.4.5.1品名： 批号： 试验组阴性对照组供试品组阳性对照菌组甘露醇氯化钠琼脂革兰氏染色血浆凝固酶单项结论验证结果：复核人： 检验人：4.4.5.2品名： 批号： 试验组阴性对照组供试品组阳性对照菌组甘露醇氯化钠琼脂革兰