乙醇对小鼠胚胎内皮型一氧化氮合酶表达影响.doc

乙醇对小鼠胚胎内皮型一氧化氮合酶表达影响【摘要】目的探讨乙醇对胚胎中枢神经系统内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因和蛋白表达的影响。方法应用器官发生期小鼠全胚胎培养模型，8.5?d小鼠胚胎以1.0，2.0，4.0和8.0?mg/ml乙醇体外染毒48?h后，对胚胎中枢神经系统发育进行评分，并以半定量RT-PCR和蛋白印迹(western blot)方法检测胚胎中脑组织内皮型一氧化氮合酶基因和蛋白表达。结果随乙醇染毒剂量增加，胚胎头长逐渐减小，中枢神经系统的前脑、中脑和后脑发育评分均逐渐降低，畸形主要表现为神经管闭合不全。乙醇抑制胚胎中脑组织内皮型一氧化氮合酶基因和蛋白表达。结论乙醇对中枢神经系统的致畸作用可能与诱导胚胎组织内皮型一氧化氮合酶过量表达、造成组织NO含量过多，进而对发育中的胚胎组织造成氧化损伤有关。 【关键词】 乙醇；一氧化氮；内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基金项目： 国家自然科学基金(30271364)Effect of ethanol on expression of endothelial nitric oxide synthase in embryonic midbrain of mice XU Yajun,LI Yong.Department of Nutrition and Food Hygiene,Peking University(Beijing 100083,China) Abstract: Objective To investigate the effect of ethanol on the expression of enothelial nitric oxide synthase(eNOS) in the central nervous system(CNS)of embryonic mice.Methods 1.0,2.0,4.0 and 8.0mg/ml ethanol were administrated respectively in vitro to mouse embryos from 8.5d to 10.5d.The development of embryonic CNS was evaluated according to standard scoring system.The mRNA and protein expressions of eNOS were evaluated by RT-PCR and western blot separately. Results The development of embryonic CNS and the mRNA and protein expressions of eNOS were suppressed by ethanol exposure.Conclusion Suppression of eNOS might play a role in the teratogenic action of ethanol in CNS. Keywords:ethanol;NO;endothelial nitric oxide synthase 孕期饮酒导致胚胎组织氧化水平增高可能是乙醇致畸的原因之一。研究显示，酒精暴露的神经细胞内一氧化氮水平明显升高1，而过量的一氧化氮能够与氧自由基结合形成高活性细胞死亡诱导复合物1，2，从而加速细胞死亡。机体内一氧化氮的形成需要一氧化氮合酶的催化，有研究显示，乙醇可普遍诱导胚胎多种组织内诱导型一氧化氮合酶mRNA表达增加，分析其可能与胚胎细胞内一氧化氮含量增加有关3，4。一氧化氮合酶的另一个异构体内皮型一氧化氮合酶主要表达于内皮系统，如脉管内皮。器官发生期的胚胎脉管系统已经开始形成并日趋完善。本研究应用啮齿类器官发生期全胚胎培养方法，研究乙醇对胚胎中枢神经组织中内皮型一氧化氮合酶表达的影响，以期为乙醇致畸的机制研究提供新思路。1 材料与方法1.1 动物健康性成熟CD-1小鼠，体重2022?g(北京大学医学实验动物中心)。每晚6点雌雄11同笼，次日晨7点检查雌鼠阴道，见到阴栓者认为受孕，当天上午定为孕0?d(GD0)， 中午12点以后定为孕0.5?d。孕鼠在恒温(220.5)，恒湿(5010)%环境中饲养，给予充足饲料和饮水。1.2 主要试剂和仪器无水乙醇、琼脂糖、蛋白酶、牛血清白蛋白、RNA酶、Tris缓冲液、考马斯亮蓝G-250(美国Sigma公司)；TRIzol试剂(美国Gibco公司)；蛋白酶K、反转录试剂盒(美国Promega公司)；KAc、NaCl、2-巯基乙醇、蔗糖(上海化学试剂厂)；青霉素和硫酸链霉素(华北制药有限公司)；体视显微镜(美国Moltic公司)；UV-9100可见紫外分光光度计(日本岛津公司)；数码相机(美国Nikon公司)；凝胶成像系统(日本复日公司)。1.3 方法1.3.1 小鼠体外全胚胎培养剂量-反应关系模型的建立根据New等5的方法建立小鼠体外全胚胎培养模型。处死孕8.5?d小鼠，无菌分离胚胎，选取35体节的胚胎进行体外培养。培养基为大鼠即刻离心血清，于56?、30?min灭活补体后使用。每只培养瓶内放34只胚胎，每个剂量组1822只胚胎。于培养基中加入无水乙醇，使其终浓度为1.0，2.0，4.0和8.0?mg/ml，对照组不加任何药品。胚胎连续培养48?h，分别于第20和30?h换气1次。培养结束后，按照Van Macle-Fabry等6的小鼠发育评价方法，对胚胎各主要器官的发育状况进行评分。1.3.2 胚胎RNA提取和RT-PCR基因表达检测形态学评分结束后，随机取对照、2.0，4.0和8.0?mg/ml 3个剂量组的胚胎各810只，以160?，4?h以上高温灭活RNA酶的器械分离各胚胎中脑组织，冰浴下匀浆，按照TRIzol试剂盒操作说明提取总RNA。采用260?nm紫外光吸收法进行RNA定量。各标本取1?μg总RNA进行反转录，反转录体系20?μl。反转录产物稀释至100?μ1后取出2?μl，加入基因引物进行PCR扩增。内皮型一氧化氮合酶基因引物7为：上游：5′TCAGTGGCTGGTACATGAG3′；下游：5′ACAGGAAATAGTTGACCATCTC3′；GAPDH基因引物8为：上游：5′TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC3′；下游：5′CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC3′。反应体系均为20?μl，加入上、下游引物各10?pmol。内皮型一氧化氮合酶基因扩增循环数为33。以管家基因DAPDH作为内参(25个扩增循环)进行产物半定量。扩增后得到的DNA片断进行1.5%琼脂糖凝胶电冰，溴化乙锭(EB)染色，以紫外凝胶成像仪照相，用Quanty One 4.4.1软件进行DNA灰度分析和比较。1.3.3 胚胎蛋白提取和对内皮型一氧化氮合酶蛋白表达的蛋白印迹(Western blot)检测按照1.3.2的方法分离胚胎中脑组织，将对照，2.0，4.0和8.0?mg/ml 4个剂量组各10只胚胎的中脑组织置于50?mmol/L Tris-HCl缓冲液(含蛋白酶抑制剂Cocktail，pH 7.4)中，冰浴下匀浆。匀浆液于4?，12?000?g离心45?min，弃上清，沉淀洗涤后用上述缓冲液溶解，以Bradfor9法测定蛋白浓度。Western blot实验方法参照文献10，单克隆抗体11000稀释后使用。以化学发光法检测条带。1.4 统计分析采用SPSS 11.0软件进行统计。用单因素方差分析法比较组间差异，差异显著者继续进行方差齐性检验，方差齐者以最小显著差法(LSD) 对多组均数进行post-hoc分析，方差不齐者以Dunnett法进行post-hoc分析。2 结 果2.1 不同剂量乙醇对体外培养小鼠胚胎发育的影响(表1)乙醇对体外培养的小鼠胚胎中枢神经系统发育的影响具有明显的剂量-反应关系。随乙醇染毒剂量的增加，胚胎头长逐渐减小，中枢神经系统的前脑、中脑和后脑发育评分均逐渐降低，畸形最主要表现为神经管闭合不全。表1 乙醇体外暴露48 h(GD8.510.5)对小鼠胚胎中枢神经系统发育的影响(略)2.2 半定量RT-PCR检测结果(图1)以管家基因GAPDH作为内参进行的半定量RT-PCR结果显示，乙醇对体外培养的小鼠胚胎中脑组织内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达呈现诱导作用。随乙醇染毒剂量的增加，胚胎中脑组织内皮型一氧化氮合酶mRNA丰度逐渐升高。2.3 Western blot检测结果(图2)内皮型一氧化氮合酶蛋白表达检测结果与其mRNA表达检测结果相一致，随乙醇染毒剂量的增加，内皮型一氧化氮合酶蛋白表达量也增加，提示乙醇对内皮型一氧化氮合酶表达呈现诱导作用。3 讨 论 本研究应用啮齿类动物全胚胎培养的方法，研究乙醇对器官发生期胚胎内皮型一氧化氮合酶基因和蛋白表达的影响。研究发现，乙醇能够从基因和蛋白水平诱导胚胎组织内皮型一氧化氮合酶表达的增加。提示乙醇导致胚胎细胞内NO含量增加可能也与内皮型一氧化氮合酶的表达上调有关。脑组织是毛细血管极其丰富的组织，脉管系统的发育伴随着整个胚胎脑部器官的发育，内皮型一氧化氮合酶的过表达很可能会直接造成发育中的胚胎脑组织内NO含量的增加，从而对组织造成氧化损伤，这可能与乙醇导致的胚胎中枢神经系统发育障碍有关。【参考文献】 1Moscatello KM,Biber KL,Jennings SR.Effects of in utero alcohol exposure on B-cell development in neonatal spleen and bone marrowJ.Cell Immunol,1999,191(2):124-130.2Inomata K,Nasu F,Tanaka H.Decreased density of synaptic formation in the frontal cortex of neonatal rats exposed to ethanol in uteroJ.Int J Dev Neurosci,1987,5(5-6):455-460.3Moscatello KM,Biber KL,Jennings SR.Effects of in utero alcohol exposure on B-cell development in neonatal spleen and bone marrowJ.Cell Immunol,1999,191(2):124-130.4Adickes ED，Mollner TJ,Makoid MC.Ethanol induced teratogenic alterations in developing cardiomyocytes in cultureJ.Alcohol,1993,(Supp)12:283-288.5New DAT.Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesisJ.Biol Rev Camb Philos Soc,1978,53(1):8l-122.6Van Macle-Fabry G,Delhaise F,Picard JJ.Morphogenesis and quantification of the development of post-implantation mouse embryosJ.Toxicol in Vitro,1990,4:149-156.7Gnanapandithen K,Chen Z,Kau CL,et a1.Cloning and characterization of murine endothelial constitutive nitric oxide synthaseJ.Biochim Biophys Acta，1996,1308:103-106.8Chen XG,Li Y,Zang Mx,et al.cDNA cloning and expression analysis of mouse gene encoding the protein Ercc61,which is a novel member of SNF2 familyJ.Prog Biochem Biophy,2004,3l(5):443-448.9Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the princip