灵芝背景介绍.doc

与目录一、灵芝多糖(GLP)31.结构特点32.1 免疫调节作用32.2 抗肿瘤作用32.药理作用442.3 抗辐射作用42.4 延缓衰老抗氧化作用42.5 对血糖的调节作用42.6 其他作用43.含量测定53.1 提取工艺53.2 显色方法及检测条件5二、灵芝三萜61.化学成分62.药理作用1062.1 抗肿瘤62.2 抗微生物62.3 降血脂62.4 抗炎症反应62.5 免疫调节73.质量控制73.1 灵芝三萜的HPLC指纹图谱73.2 含量测定72灵 芝 研 究 背 景 资 料灵芝为担子菌纲，多孔菌科，灵芝属真菌赤芝(Ganoderma lucidum)和紫芝(Ganoderma sinense)的总称。灵芝分布在我国黑龙江、吉林、河北、山东、山西、内蒙古、安徽、江苏、浙江、江西、广东、广西、贵州、云南、湖南、福建及台湾等地。野生灵芝资源有限，而且越来越少，人工栽培灵芝的技术已在全国推广，其产量与数量早已超过野生灵芝。灵芝在我国有悠久的药用历史，始载于神农本草经，具有补中益气，滋外强壮，扶正固本，延年益寿等功效。现代研究表明灵芝的有效成分主要为灵芝多糖和灵芝三萜。现将这两类化合物从化学组成，药理作用，分析方法角度分别讨论如下。一、灵芝多糖(GLP)1.结构特点灵芝多糖为米黄色，沸水回流法从赤灵芝子实体中提取得率为2% 左右，其含量43%, 质量主要为2105的生物大分子1。灵芝多糖含有三螺旋体构型，GC-MS分析灵芝多糖的主要单糖组分为葡萄糖，还有少量的半乳糖、甘露糖、木糖和艾杜糖，IR及1H-NMR分析多糖为-构型，HIO4氧化、Smith降解和甲基化分析表明：多糖主要为(1-3)糖苷键连接构型，并伴有少量的1-6位支链键连接的结构，灵芝多糖是由D-葡萄糖单元通过-(1-3)糖苷键连接葡聚多糖，其主要构型特征为(1-3)-D-线性连接的骨架结构2。2.1 免疫调节作用2.1.1对T细胞的作用：李明春等研究表明，GLP能迅速提高静息T细胞中三磷酸肌醇(IP3 )的浓度，且被Gp蛋白抑制剂PTX所抑制，还可显著促进静息T细胞中二酞基甘油(DAG)的合成，而对活化T细胞则无作用。2.1.2对B细胞的作用：成熟的B细胞膜上存在CD35 (C3b，受体)。刘景田等研究表明，采用GLP作用过的红细胞做红细胞C3b受体花环率试验，其花环形成率明显提高，说明GLP的作用可能与提高红细胞膜 C3b免疫活性有关。2.1.3对巨噬细胞（M）的作用：GLP并无细胞毒作用，不能直接杀死肿瘤细胞，而是通过增强M细胞的吞噬功能、促进T淋巴细胞增殖、增强NK细胞的细胞毒作用、诱导某些免疫因子生成等途径来抑制肿瘤的生长。2. 1.4对细胞因子的影响：GLP可促进小鼠脾细胞原代培养时IL-1及TNF mRNA的表达，从而促进IL-1及TNF的合成与分泌；并促进IL-2及IL-3 mRNA的表达，增强IL-1和IL-3的合成与分泌。2.2抗肿瘤作用在体外GLP不能直接抑制或杀伤肿瘤细胞，也不能诱导肿瘤细胞凋亡，但GLP能够增强巨噬细胞的吞噬功能，促进淋巴细胞增生，增强T杀伤细胞的细胞毒作用，促进免疫细胞产生IL-2、IFN、TNF等而间接诱导肿瘤细胞凋亡。82.药理作用42.3抗辐射作用辐射对机体造成损害的机制之一是产生大量自由基，引发一系列脂质过氧化反应，引起细胞中核酸、蛋白质分子结构的破坏，最终对各组织和器官造成严重的损害，同时，辐射引发免疫功能降低，造成死亡。吴京燕等观察了GLP合剂对辐照小鼠外周血白细胞及超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响。发现受试组白细胞数量及SOD活性较模型组显著提高。2.4延缓衰老抗氧化作用游育红等发现，灵芝多糖肽(GLPS)体外给药瞬间即可迅速减少静息状态小鼠腹腔巨嗜细胞氧自由基含量，表明GIPS可能对已经存在的自由基有直接清除作用，使细胞内总自由基水平迅速下降。2.5对血糖的调节作用GLP具有显著的降血糖功效。罗少洪等发现，GLP的灌胃剂量100 mgkg时，可明显降低高血糖小鼠血糖水平，无剂量-效应关系；剂量为200mgkg时，可降低正常小鼠的血糖，明显刺激胰岛素分泌，并明显增强高血糖小鼠对葡萄糖的耐受力。2.6其他作用GLP还具有多种生物活性：对循环系统的调节作用，降低血脂，保护肝脏，促进骨髓和血液合成DNA、RNA及蛋白质，促进人体产生抗体、干扰素，抗病毒感染等。3.含量测定近年来文献中灵芝多糖的含量测定方法基本为水提醇沉，紫外检测，操作步骤为：A：灵芝药材或制剂加水提取。B：水提液加适量乙醇（灵芝多糖在一定的乙醇浓度下溶解度最低），使灵芝多糖沉淀。C：多糖沉淀加水溶解，加显色剂显色。D：用紫外分光光度计测定吸光度。3.1提取工艺灵芝多糖是一种大分子的化合物，分子量从数千到数十万，不溶于高浓度的乙醇，微溶于低浓度乙醇及冷水中，可在热水中溶解5。可见，灵芝多糖的性质不同于一般小化合物，为确保含量测定结果的准确度和精密度，应首先对其提取工艺进行考察。张志军6等以赤芝为样品，对浸提过程中的温度、时间以及固液比3 个因素进行了单因素试验和正交试验, 结果表明,灵芝多糖的最佳提取条件为浸提温度90 ,浸提时间2.0 h ,料液比115 ;浸提温度对多糖提取率的影响最大,其次为浸提固液比和浸提时间。其试验结果表明，6090间，随着浸提温度的提高，提取率也不断增加，90100间，随着浸提温度的提高，提取率基本不变。李艳7等优化确定的灵芝多糖提取工艺为:一提料液比为130, 提取时间为3 h, 提取温度100, 盐浓度0.5 ;二提料液比为115, 提取时间为1 h,提取温度为100,盐浓度为0.5 。将水提液浓缩,然后用截留分子量为1 000的超滤膜除盐或加入1. 2倍的乙酸除盐,再用95乙醇将溶液乙醇浓度调至75 ,得到的沉淀真空干燥,即可得到灵芝粗多糖。3.2显色方法及检测条件常用的显色方法有硫酸蒽酮显色法和硫酸苯酚显色法。毛维伦8等用0.2%的硫酸蒽酮溶液做显色剂，沸水浴加热3min，室温放置20min，波长625nm下测定。李坚等9通过方法优化确定以无水葡萄糖为对照品，用5苯酚溶液1.0 ml和硫酸5.0 ml做显色剂，于100水中放置30 min，在490 nm最大吸收波长处进行灵芝多糖含量测定的方法。中国药典2010年版10对灵芝多糖的测定采用硫酸蒽酮法。该法以无水葡萄糖为对照品，0.1硫酸蒽酮溶液为显色剂，于沸水浴加热15min，冰浴15min，在625nm下测定吸光度。郭晓蕾11等比较了药典中硫酸蒽酮法和硫酸苯酚法测定灵芝多糖的差异。通过方法学验证，证明硫酸蒽酮法的重现性好于硫酸苯酚法。原因可能是硫酸苯酚法的影响因素较多，如硫酸加入量，苯酚加入量，反应时间，反应温度等，另外，苯酚不稳定，见光或氧即逐渐氧化成淡红色，在490nm测定条件下造成干扰。多糖含量测定应用滴定法的报道较少，主要有姆松华尔格法。黄祥远12等以姆松华尔格法测定灵芝提取物中多糖的含量，以菲绕林亚铁为指标剂，以高锰酸钾滴定液滴定.记录消耗高锰酸钾滴定液含量，再查哈蒙德表即可计算相应的糖量。实验表明：该法测定结果重复性好，其测得值与苯酚硫酸法接近，且RSD 值小于后法，但操作步骤比后法多。二、灵芝三萜 1.化学成分 对灵芝脂溶性成分的研究在20世纪80年代达到了高潮，1982年Kubota等首次分离到灵芝酸A(ganoderic acid A)和灵芝酸B(ganoderic acid B)，至1988年从灵芝属中分离得到103种三萜类新化合物7。自1991-2002年，从灵芝属真菌的子实体、孢子粉和菌丝体中先后又分离到19个三萜类新化合物8。 灵芝中三萜类化合物中最主要是灵芝酸(37)种9,包括灵芝酸A、B、C、C2等，另外还有灵芝草酸，赤芝酸，丹芝酸，灵芝孢子酸，灵芝醇，丹芝醇A、B，环氧灵芝醇A、B、C，灵芝萜烯二醇，灵芝萜烯三醇，灵芝醛A、B，赤芝孢子内酯A、B，赤芝萜酮A、B、C等3。其他化学成分：灵芝中还含有核苷类化合物，氨基酸、蛋白质类化合物，甾醇类化合物，生物碱类化合物，无机元素等10。2.药理作用10 2.1抗肿瘤灵芝三萜对多种肿瘤细胞的生长和转移都有抑制作用。灵芝酸通过阻断人肝瘤细胞株BEL7402细胞周期Gl期向S期转变，使细胞周期停滞从而抑制癌细胞的生长，在浓度500g/ml时，其抑制率可以达到70，但对正常人的肝细胞株L02并没有影响。2.2抗微生物 有抗结核杆菌，抗病毒，抗真菌等作用。分离自长管灵芝(G.annulare)的applanoxidic acid A，C和F可以抑制真菌狗小孢霉(Microsporum cannis)和须发藓菌(Trichophyton mentagrophytes)的生长。2.3降血脂灵芝醇A，灵芝醇B，灵芝醛A，灵芝酸Y这类26一oxygenosterols物质具有抑制人肝细胞株合成胆固醇的生物效应，灵芝中氧合的固醇抑制胆固醇的生物合成是通过胆固醇的前体醋酸或甲羟戊酸的转变实现的。2.4抗炎症反应灵芝三萜中的某些化合物对由中性粒细胞等释放的炎症介质有抑制作用。在哮喘的鼠模型中，富含灵芝三萜的提取物显著减弱了气道高反应性，减少了总体粒细胞和嗜酸性粒细胞的浸润，减少了炎症介质的水平，例如支气管肺泡灌洗液中的IL-4，IL-5和嗜酸细胞活化趋化因子，从而发挥抗炎症反应作用减弱Th2介导的反应。2.5免疫调节 灵芝醇F，灵芝酮二醇，灵芝酮三醇能有效地抑制补体激活的经典途径。灵芝酸能促使带lewis肺癌的Guinea猪体内IL-2的含量上升，并提高起NK细胞的免疫活性，具有免疫促进功能。3.质量控制3.1灵芝三萜的HPLC指纹图谱李保明等11分析了13个批次的赤芝子实体,并建立了三萜酸特征图谱,确定了19个共有峰,其中包括灵芝酸、灵芝酸C2、赤芝酸LM1、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸A、12 - 乙酰基- 3 - 羟基- 7, 11, 15, 23 - 四羰基- 羊毛甾- 8 - 烯- 26 - 酸、灵芝酸D、赤芝酸A、灵芝烯酸D、灵芝酸C、灵芝酸E、灵芝孢子酸A共15个已知化合物峰以及4个未知化合物峰,有13批赤芝样品特征图谱与对照特征图谱相似度均在0.9以上。刘宁12等对16批样品HPLC分析建立了包含10个色谱峰的图谱，但未对各个峰代表的化合物进行确证。其分析结果表明灵芝药材成分复杂，不可能每个组分都得到较好的分离，因此有一些色谱峰其精密度和重现性的峰面积有一定差异，不同的样品间峰面积差异较大。3.2含量测定 灵芝三萜酸达一百多钟，但含量均较低，对照品分离难度大，成本高，使含量测定方法的普及受到限制。3.2.1总三萜酸含量测定 李保明等13 选用灵芝酸B为对照品,建立了定量测定灵芝总三萜酸含量的方法,采用比色法测定了灵芝属3个种赤芝Ganoderma luceidum ,紫芝G. sinense,松杉灵芝G. tsugae等8个样本的总三萜酸的含量。3.2.2活性成分的含量测定 马林等14以赤芝孢子酸A(ganosporeric acid A ,1) ,赤芝酸A(lucidenic acid A ,2) ,灵芝酸B(ganoderic acid B ,3) 和灵芝酸C(ganoderic acid C ,4) 为对照品;色谱柱:反相C18 ;流动相:乙腈-水(3763) ;流速:1.0 mL/min ;检测波长:UV 254 nm。结果表明进样量在0.21g 有良好的线性关系, (1) , (2) , (3) 和(4) 的加样回收率分别为100.9 % ,101.2 % ,101.3 %和101.7 %,能快速、简便、灵敏和分离度好,适用于灵芝子实体、孢子粉、发酵菌丝体及相关制剂的三萜类物质检查和含量测定。参考文献1 何晋浙,邵 平,倪慧东,柴能杰,孙培龙. 灵芝多糖结构及其组成研究. 光谱学与光谱分析,2010,30(1):1232何晋浙,邵平,孟祥河,孙培龙.灵芝多糖的结构特征分析.分析化学,2010,38(3):3723刘思好.灵芝化学成分的研究.沈阳药科大学硕士论文,20074戴则林,董昌武.灵芝多糖的生物活性研究进展.安徽中医学院学报,2005,24(5)5徐锦堂.中国药用真菌学.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社6 张志军,李淑芳,刘建华.灵芝多糖提取水浸提条件的研究.天津农学院学报,2005,12(1):127李艳,赵海燕,吕建宁.灵芝多糖提取工艺研究. 灵芝多糖提取工艺研究,2006,28(7):10528毛维伦,许腊英,李顺超.灵芝胶囊中多糖含量的测定.中国医院药学杂志,2001,21(7):4469李 坚，刘东波，夏志兰，涂洪强. 分光光度法快速测定灵芝中多糖含量. 湖南农业科学2009,34 (2):6010中国药典2010版11 郭晓蕾,朱思潮,翟旭峰,王怀豫,宝丽. 硫酸蒽酮法与硫酸苯酚法测定灵芝多糖含量比较. 中华中医药学刊,2010,28(9)12陈若芸,于德泉.灵芝三萜化学成分研究进展.药学报,1990,25(12):94013罗俊,林志彬.灵芝三萜化合物药理研究进展.药学学报,2002,37(7):57414曾祥丽,包海鹰.