第二十三章 囊胚培养-孙正怡.doc

囊胚培养北京协和医院 妇产科 生殖中心孙正怡前言世界首例试管婴儿成功妊娠的患者，移植的胚胎就是囊胚期胚胎。但是多年来IVF实践中，大多数医生仍然选择在卵裂期进行移植。这么做的主要原因是无法确保将胚胎进行培养后能否形成囊胚。上世纪九十年代后，通过动物胚胎的研究，人们对胚胎的营养需求有了更深刻的理解，建立了序贯培养的概念，从而使得囊胚形成率有了大幅度改善，接受IVF治疗的患者更易于从囊胚培养中获益。囊胚培养的目的囊胚培养的最主要目的是改善IVF治疗的妊娠率IVF。囊胚培养具有筛选胚胎的作用。经过较长时间的培养后，形成囊胚的胚胎，非整倍体比例明显低于第三天胚胎。另外由于胚胎与子宫内膜的同步性更好，也有利于提高妊娠率。对于一名妇女经过IVF治疗得到的一批胚胎，进行囊胚培养可以筛选出发育潜能最好的一部分胚胎，从而使妊娠率保持一定水平的基础上，减少移植和冷冻胚胎的数量，减少多胎的发生，并降低治疗费用。囊胚培养的优势与风险优势囊胚的种植率高于卵裂期胚胎，从而可以减少移植胚胎数量，移植时内膜与胚胎发育更为同步，Papanikolaou 等发现HCG日P值升高对第三天的植入率有不良影响，而到了第5天，影响明显减小。第三天极度黄素化的内膜状态会影响卵裂期胚胎发育到囊胚。而囊胚受这种影响则较小。子宫腔内pH值较输卵管内低。早期胚胎对酸度的适应能力较差，而囊胚对酸度的适应功能较好。因此在囊胚期时移植，胚胎的存活率较高。染色体异常比例下降。Day3的“优质胚胎”，有60左右发育为囊胚，40不能发育为囊胚，卵裂期的优质胚胎，有60可能为非整倍体，而发育到囊胚的胚胎，非整倍体率降为30左右。进行囊胚培养由于培养时间延长，利于PGD的进行，尤其是结合使用array CGH等较为先进的诊断技术，可以大大提高胚胎的种植率。风险取消移植：由于至今仍缺乏有效的指标判断卵裂期胚胎发育成囊胚的能力，所以，即使卵裂期胚胎形态良好，也难以避免无囊胚移植的风险。通常使用的预测指标是卵裂球的数目和碎片的量，有文献证实这两种指标和囊胚的形成率有一定关系。但是，患者之间囊胚形成的比例差异极大，因此，如果不加筛选的进行囊胚培养，会导致大量的取消移植。延长培养时间，可能会导致基因甲基化修饰异常的风险增加。但由于目前此类疾病发生比例极低，相关报道还不足以证实囊胚培养与甲基化异常疾病之间的关系。性别比（男性增加）改变：有多篇文献提示囊胚移植后男性婴儿比例增加，但是也有一些文献的结果不支持这一结论。性别比改变的机制也没有完全阐明，是培养液造成的，还是不同性别的胚胎形态质量不同，仍不确定。单卵双胎：自然妊娠的单卵双胎几率约为200330分之一，有报道认为囊胚培养增加单卵双胎的几率（Behr 2000）。单卵双胎导致流产、先天畸形（高达10）、双胎输血综合症、甚至联体双胎，已经发现动物单卵双胎的基因印记异常发生率更加增高。囊胚培养导致单卵双胎比例增加可能与培养导致透明带改变，从而影响孵出有关。囊胚培养的方法培养方案与其他细胞进行共培养的技术，由于技术复杂已经基本被淘汰。目前最常用的囊胚培养的方法是序贯培养。所谓序贯培养是根据体外培养的胚胎在不同发育时期代谢需求的不同，依次采用适合该时期营养需要的培养液进行培养。目前世界范围内各个主要的培养液生厂商均有相应的囊胚培养液商品化供应。在取卵后72小时，经过胚胎形态评估后，将卵裂期胚胎按照形态分组，类似形态的胚胎放置在同一囊胚培养液的液滴中培养。低氧培养大气中氧气的浓度为21%，在氧气浓度未加控制的二氧化碳培养箱内，氧气浓度约为20%，虽然在此条件下，卵裂期胚胎也有相当的比例能够形成囊胚，但是如果采用低氧培养，将氧气浓度降至5%，囊胚形成率能够有一定程度的提高，而且囊胚质量会有明显改善。集合培养集合胚胎培养是指在单个培养液滴内将多个胚胎放在一起培养。胚胎分泌的一些生长因子具有自分泌和旁分泌作用，利于胚胎的生长发育，但不如集合培养的胚胎生存力强，胚胎量多时比少时易于培养。 鼠胚试验已经证实当10个左右的胚胎一起培养，可以获得更好的卵裂率及囊胚形成率。人胚胎的集合培养与单独培养相比，致密化率及囊胚形成率均有提高。集合培养组获得的囊胚质量更好，因此得到的囊胚活产率更高。推荐的集合培养方法是在30ul50ul囊胚培养液液滴内放置35枚胚胎。囊胚的观察方法及形态学评分囊胚培养过程中，囊胚的形态学评分非常重要，评分后便于衡量囊胚的质量，选择移植或冷冻的胚胎。目前世界范围内主要采用的评分方法是Gardner和Schoolcraft在1999介绍的评分方法，该方法对囊胚的扩张状态、内细胞团(ICM)和滋养层 (TE)进行评分，2011年的伊斯坦布尔共识(Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology, 2011)，对囊胚的评价采用的主要还是这种评分方法。虽然胚胎发育到囊胚后，非整倍体的比例下降，但是仍存在一定比例的非整倍体胚胎，而囊胚的形态学评分并不能可靠地估计非整倍体现象的存在。观察时间卵母细胞受精后第5天有可能发育到囊胚期，细胞间开始形成囊腔，内充满液体。形成囊胚后，细胞出现首次分化，形成滋养细胞和内细胞团细胞两种不同的细胞成分。滋养外胚层细胞形成连续的一层，围成一个球面，衬于透明带内侧。在滋养细胞层内侧，可以看到明显的内细胞团，质量良好的内细胞团是个由许多细胞形成的致密细胞团，细胞总数可达60个以上。但是由于不同质量的胚胎发育速度不一致，有的胚胎有可能在受精后第6天、第7天甚至更晚才形成囊胚。已经有大量的文献证实，较早形成的囊胚发育潜能可能较佳，移植后可以获得更好的妊娠率，第7天及以后形成的囊胚，染色体异常的几率增加。有一些文献认为第5天和第6天形成的囊胚，如果质量接近，则可以获得类似的妊娠结局。第7天及更晚形成的囊胚依然有少数获得妊娠并分娩正常新生儿的病例报告。目前国内外的共识是囊胚的观察时间应该在受精后第5天第6天。观察方法胚胎发育到囊胚阶段后，随着囊胚腔的扩张，囊胚的直径会逐渐增大，从受精卵的160um左右增加到180230um左右。透明带逐渐变薄。在使用倒置显微镜观察囊胚时，由于40物镜的景深有限，仅能看清少数几层细胞（20um左右）厚度内的结构，因此为了清楚而全面地观察囊胚的内细胞团和滋养细胞层的质量，需要调整物镜的高低，从囊胚的顶部观察到底部，获得囊胚质量的全面印象。物镜聚焦在囊胚中部可以看清滋养细胞的侧面，呈镰刀状、新月形或梭形，质量好的滋养细胞层细胞大小较为一致，沿透明带内侧均匀规则排列。可以对这一“赤道面”上的滋养细胞进行大小的测量和计数。聚焦在囊胚顶部或底部时，可以清楚地观察到滋养细胞的正面，呈近似的圆形或多边形，并能够很容易观察到滋养细胞的细胞核以及核仁。质量良好的滋养细胞层，滋养细胞大小一致，近似六边形，互相镶嵌呈铺路石样。由于内细胞团往往位于囊胚的底部，将物镜聚焦到此高度，可以清楚观察到内细胞团的大小、细胞组成和折光情况，对内细胞团大小进行测量也比较容易 评分方法（一）囊胚腔扩张的程度囊胚腔扩张程度的判断，对于下一步评价滋养细胞层和内细胞团的质量以及决定对囊胚的操作都非常重要。根据囊胚腔的大小和是否孵化将囊胚的发育分为六个时期：1期：早期有腔室囊胚，囊胚腔小于胚胎总体积的1/2；2期：囊胚腔体积大于或等于胚胎总体积的1/2；3期：完全扩张囊胚，囊胚腔完全占据了胚胎的总体积；4期：扩张囊胚，囊胚腔完全充满胚胎，胚胎总体积变大，透明带变薄；5期：正在孵出的囊胚，囊胚的一部分从透明带中逸出；6期：孵出的囊胚，囊胚全部从透明带中逸出。（二）内细胞团分级内细胞团的大小与质量，与种植率存在密切关系。内细胞团微呈卵圆形，在囊胚发育到3期以后，内细胞团的大小变化不明显。1期、2期的早期囊胚，由于囊腔较小，难以准确区分内细胞团的界限。质量良好的内细胞团直径通常在6080um左右。内细胞团较小、细胞连接松散或能观察到退化坏死的细胞，则质量不理想，种植率降低或染色体异常的可能性更大。因此，处于3至 6期的囊胚，应对其内细胞团进行质量分级。内细胞团分级：A级：细胞数目多，排列紧密；B级：细胞数目少，排列松散；C级：细胞数目很少。（三）滋养层细胞的分级由于滋养细胞的分裂速度比较快，因此曾有人认为滋养细胞的数量对于种植率影响不大，但是最近几年的研究发现，滋养细胞层的质量，对种植率有重要影响，甚至多篇文献认为其质量的好坏对种植率的影响大于内细胞团质量的作用。3至 6期的囊胚的滋养层细胞分级：A级：上皮细胞层由较多的细胞组成，结构致密；B级：上皮细胞层由不多的细胞组成，结构松散；C级：上皮细胞层由稀疏的细胞组成。（四）其它评价内容人类囊胚分级系统的主观性仍较强，迫切需要一个统一的量化指标对囊胚质量进行分级界定。另外，在观察囊胚时，还会出现其他一些情况，未被包含在人类囊胚分级系统的描述中。【皱缩的囊腔】 有时观察囊胚时会发现部分囊胚的囊腔塌陷，或称为皱缩。此时难以对滋养细胞层和内细胞团进行准确的质量评估。实际上，多数囊胚从早期发育到完全孵出（3期到6期）的过程中，会发生多次囊胚的自然皱缩和恢复扩张，但是皱缩状态持续的时间很短，通常不超过1小时，因此观察到皱缩状态的机会较少。对于这种囊胚，可以等待1小时，待囊腔扩张后进行重新评分。如能够重新扩张，则对种植率几乎无影响。【碎片】在卵裂期胚胎内的碎片，有一部分在发育过程中吸收，但有部分在随后的胚胎致密化过程中，被致密化的细胞团排除在外，随着囊腔的形成，被挤压在滋养细胞层和透明带之间，如果囊胚腔塌陷，则更容易分辨，这些碎片附着于透明带。在随后囊胚孵出的过程中，这些碎片残留在透明带内，不参与后续的胚胎发育与着床。由于胚胎从受精后发育到囊胚的阶段，来自卵母细胞提供的原生质总量没有增加，因此碎片的存在，往往伴随着滋养细胞和内细胞团细胞数量与形态评分的下降。【大细胞】部分胚胎在致密化过程中，还有可能将整个细胞排斥在外，或者包裹在其内部，囊腔形成后，这些大细胞存在于囊胚内或囊腔外。与碎片类似，这种情况，通常对种植率没有明显影响，但是大细胞的存在，往往伴随着囊胚滋养细胞层或内细胞团评分的下降。1. GardenerDK， Schoolcraft WB. In vitro culture of human blastocyst. In: Jansen R, Mortimer D, eds. Towards Reproductive Certainty :Infertility and Genetics Beyond 1999. Carnforth:Parthenon Press, :3782. Guerif F, Le Gouge A, Giraudeau B, et al. Limited value of morphological assessment at days 1 and 2 to predict blastocyst development potential: a prospective study based on 4042 embryos. Hum Reprod 2007;22:1973-813. Gardner DK, Stevens J, Sheehan CB, et al. Morphological assessment of the human blastocyst. In: Elder KT, Cohen J, eds. Analysis of the Human Embryo. Londo