盐处理对无瓣海桑和拉关木幼苗抗氧防御的研究.doc

海 南 师 范 大 学本 科 优 秀 毕 业 论 文 研究课题：盐处理对无瓣海桑和拉关 木幼苗抗氧化防御的研究 姓 名： 黄 敏 学 号： 200808101216 专 业： 生 物 科 学 年 级： 2008级 系 别： 生物科学系 完成日期： 2012年5月 指导教师：李妮亚 研究员 本科生毕业论文（设计）独创性声明 本人声明所呈交的毕业论文（设计）师本人在指导老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文中没有抄袭他人研究成果和伪造数据等行为。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 论文（设计）作者签名： 日期： 本科生毕业论文（设计）使用授权声明 海南师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交毕业论文（设计）的复印件和磁盘，允许毕业论文（设计）被查阅和借阅。本人授权海南师范大学可以将本毕业论文（设计）的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存、汇编毕业论文（设计）。 论文（设计）作者签名： 日期： 指导教师签名： 日期： 目 录 前言.21. 材料与方法 1.1实验材料 1.1.1 供材料与选样的方法.3 1.1.2 主要仪器与试剂.4 1.2 实验方法 1.2.1 SOD活性测定.4 1.2.2 APX活性测定.5 1.2.3 POD活性测定.5 1.2.4 CAT活性测定.5 1.2.5 GR活性测定.6 1.2.6 O2-产生速率测定.6 1.2.7 蛋白质含量的测定.6 1.2.8 数据分析.62. 结果与分析 2.1 不同盐度活性氧比较.7 2.2 不同盐度酶活性比较.73. 讨论 3.1 盐度对无瓣海桑抗氧化酶系统的影响.10 3.2 盐度对拉关木抗氧化酶系统的影响.11 3.3 两种红树植物盐处理抗氧化防御的比较.11 4.结论.12 致谢 .12参考文献.12 盐处理对无瓣海桑和拉关木幼苗抗氧化防御的研究 作者： 黄敏 指导教师： 李妮亚 研究员 (海南师范大学生命科学学院，海口，571158）摘 要：无瓣海桑( Sa) 、拉关木(Lr) 都属于乔木红树植物。这2种红树植物对盐度的敏感程度存在着差异, 因此对不同标准的盐度的适应性也大不相同。通过对这2种红树植物用不同盐度的水溶液处理,进行了O2-产生速率的测定，POD、 SOD 、APX 、CAT 、GR等抗氧化酶活性的测定及初步研究。结果表明：无瓣海桑和拉关木的O2-含量的含量先上升后下降，其SOD活性与02-产生速率呈负相关。拉关木（Lr）主要依靠SOD CAT POD来消除活性氧自由基，而无瓣海桑（Sa）的的SOD APX POD活性极显著低于拉关木（Lr），说明拉关木（Lr）抗氧化能力强于无瓣海桑（Sa）。根据实验结果，可以得出这2种红树植物对盐度的适应范围，这将为指导中国南海海岸线上的红树林育种提供依据。关键字: 无瓣海桑 拉关木 盐处理 活性氧 抗氧化酶 Study on antioxidant defense of Sonneratia apetala and Laguncularia racemosa under salt stress Author：Huang Min Tutor：Research Fellow Li Niya (Department of Biology, Hainan normal university，Haikou, 571158)Abstract: Sonneratia apetala and Laguncularia racemosa are both belong to arboreal mangrove plants. The sensitiness impact of salinity on two arboreal mangrove plants are different. The two mangrove species are treated with different salinity levels over 1- month period, and then assay their Reactive Oxygen Species and POD SOD APX CAT .etc. The results show that the generation of O2- is rasing at first then droping, the activity of SOD is negative correlation with O2-. Laguncularia racemosa clears ROS mainly depending on SOD CAT POD. The activity of SOD APX POD in Sas is lower than Lrs, so antioxidant defense is weaker than Laguncularia racemosa. Results of this expermi ent identified salinity levels best suited for growth and metabolism of the species providing information needed form aintaining mangrove forestation a long the South China coast .Key words: Sonneratia apetala Laguncularia racemosa salt stress ROS antioxidant enzymes 前言 红树林（Mangrove）指生长在热带、亚热带低能海岸潮间带上部的特殊木本植物类群。生长于陆地与海洋交界带的滩涂浅滩，是陆地向海洋过度的特殊生态系，其生境条件、组成成分、形态结构、繁殖和传播方式，以及生理生化过程等都具有独特性，并且具有巨大的经济、社会和生态效益。对红树林生态系统的研究是当前国内外众多科学工作者关住的前沿热门研究领域。由于海水环境条件特殊, 红树林植物已特化出一套有别于陆生或淡水生植物的适应机制。一般认为, 红树植物的生长发育需要一定的盐度条件1,2 。不同的红树植物其耐盐范围也不同, 高于或低于该范围, 生长将受到抑制甚至导致死亡；而对适宜的盐度范围之外的低盐度或高盐度胁迫,不同红树植物的敏感程度以及生理反应不尽相同, 其体内主要的生理生化反应也会受到不同程度的影响, 例如光合作用、蛋白质合成、能量和油脂代谢等3 植物在正常条件下细胞内活性氧的产生和清除处于动态平衡状态，自由基水平低，不会伤害细胞.而逆境胁迫,如盐胁迫、水分胁迫、紫外损伤和病原菌入侵等可打破这一平衡，导致自由基的过量积累。为了避免氧化胁迫，植物体自身具有一套抗氧化酶系统来消除多余的活性氧。主要的抗氧化酶有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）等，抗氧化剂主要有抗坏血酸（Ascorbate）、还原性谷胱甘肽（GSH）等。它们主要存在于叶绿体和胞浆中，形成高效的抗坏血酸。SOD能够将超氧阴离子自由基分解成O2和H2O2，CAT能够进一步将H2O2降解成H2O和O2。抗坏血酸过氧化物酶是清除H2O2（过氧化物酶（APX）也称维生素C过氧化物酶，是植物细胞中防御外界氧化胁迫和特别是叶绿体中的H2O2）的关键酶，从而起到对植物体的保护作用。抗坏血酸物本身是活性氧代谢的重要抗氧化酶类，在降低H2O2对植物细胞产生氧化损伤方面起关键作用。过氧化物酶（POD）是一类广泛分布于生物界的重要氧化还原酶，是生物体内的保护性酶类。它们在生物体内组成清除活性氧自由基的多酶复合体系，具有抗自由基的联合、协同作用。 无瓣海桑(Sa)、拉关木（Lr)是我国南部沿海重要的2种红树优势种。无瓣海桑是由孟加拉引种而来, 并成为沿海造林运动的主要树种4之一；拉关木是由墨西哥引种而来，其抗盐能力明显优于乡土树种5。本文以海南岛东寨港无瓣海桑和拉关木幼苗为研究对象，对幼苗进行盐处理，研究其抗氧化酶活性和活性氧，比较这2种红树植物抗氧化防御的差异。有助于揭示盐度变化对2种红树植物生长的影响, 为耐盐树种的选育提供一些参考指标。可以进一步了解红树植物对其生境的适应性，是红树林成功恢复的基础。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 供材料与选样方法 无瓣海桑、拉关木幼苗于2011年12月采自海南省海口市东寨港红树林自然保护区( 1951N, 11024E )海滩自然生长的红树林幼苗。每种红树幼苗挑选大小基本一致的植株作为实验材料。将红树幼苗移栽于盛有细沙和黑土混匀的基泥的塑料花盘中培养。待幼苗存活（长出23片新叶）后,设置4个盐梯度（100mM NaCl、200mM NaCl、300mM NaCl、400mM NaCl),每个梯度都有3盆树。每个梯度用100mM NaCl溶液处理的时间分别为7天、14天、21天、28天，每7天更新换置100mM NaCl。每个红树树种设置一个对照组，以浇1/6完全营养液为对照。处理后取其叶子用锡箔纸包好装入小塑料瓶中再放入-72冰箱中冷冻以备实验测定。这个阶段从2011年12月持续到2012年4月。 1.1.2 主要仪器和试剂 仪器：eppendorf5417小型高速冷冻离心机，超低温冰箱( MDF U4086s),723N可见光分光光度仪，紫外分光光度仪，万分之一电子分析天平，液氮罐，移液枪。 试剂：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、抗坏血酸、Polyvinylpyrrolidone、乙二胺四乙酸二钠、核黄素、乙二胺四乙酸、30%过氧化氢、NADPH、L甲硫氨酸、NBT、愈创木酚、亚硝酸钠、羟氨氯化物、对氨基苯磺酸萘胺、考马斯亮蓝G-250。1.2 实验方法1.2.1 SOD活性测定 SOD活性测定采用氮蓝四唑（Nitro Blue Tetrazolium chloride)比色法6。反应体系：先滴加1.5ml 0.05mol/L磷酸缓冲液，然后滴加0.3ml 130mmol/L甲硫铵酸、0.3ml 750umol/L的氮蓝四唑、0.3ml 100umol/L EDTA-Na2液和0.3ml 20umol/L的核黄素，最后加入0.25ml 蒸馏水。测定管加酶液0.05ml ,对照管加0.05ml的磷酸缓冲液。对照管和测定管各取两只（各管的透光尽量一样），混匀后，把一支对照管放在暗处，其它3支置于4000Lx日光灯下反应6min（此时为对照照光管的吸光度达到最大值），然后在560nm比色，记下吸光值。1.2.2 APX活性测定 APX活性测定参照沈文飚7的方法：3ml反应液中含双蒸水2.930ml，0.02ml 15mmol/L抗坏血酸（ASA）和酶液0.03ml，再加入0.03ml 30mmol/L H2O2，然后在290nm下测定其活性，一加入H2O2 20秒开始计时，每10sec记录一个值，记录10次。以不加H2O2为对照。以每分钟氧化1umol ASA的酶量为一个酶单位。1.2.3 POD活性测定 参考Kochba(1977)，采用愈创木酚法。称取1g叶子，用20mM(pH6.0)磷酸二氢钾冰浴研磨提取，在4。C下，1500g离心15min，取上清液定容到25ml。反应混合液：50ml 0.1M磷酸缓冲液(ph=6.0)于烧杯中，加入愈创木酚28uL，加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加30%H2O219uL，混匀后保存于冰箱中。反应体系：3ml的反应混合液和1ml酶液，未加酶液的反应体系加入1ml磷酸二氢钾，摇匀，同时记下时间，470nm比色，每30秒记录一个数据，一共记录5次，以每分钟内470nm变化0.01为一个过氧化物活性单位。1.2.4 CAT活性测定利用H2O2（消光系数39.4mM-1cm-1）在240nm下降的速率来测定CAT的活性（Aebi，1984）。反应体系：50uL 2%H2O2；30uL 酶液 ；2920uL双蒸水。室温控制在25。C，加酶液后启动反应，240nm比色。20s开始计时，10s记录一次，记录10次。以不加酶液为对照。 1.2.5 GR活性测定 反应体系:50mMPBSK PH7.8 1.97ml；2mMNa2EDTA 0.3ml；0.5mMGSSG 0.3ml； 0.15mMNADPH和酶液80uL.按上述顺序加入，然后在340nm下比色，一加入NADPH就开始计时，20s记录一次，记录10次。以不加NADPH为对照。 1.2.6 O2-产生速率测定 采用王爱国，罗广华的方法8进行测定。取酶提取液1mL于7mL的离心管中（对照用1mL的磷酸缓冲液代替酶液），加入1mL 50mM PBS-Na(PH7.8)和1mL 10mM羟氨氯化物混匀后，35。C水浴1h后，取1ml上述混合液于7mL的离心管中，再加入17mM的对氨基苯磺酸1ml、7mM的a-萘氨1ml，35C水浴25min，最后加入3ml乙醚，混匀离心(1500g，5min)取下层液相在530nm比色测吸光值。用NaNO2 作标准曲线，从标准曲线上求出O2-的浓度，再换算成O2-产生速率。1.2.7 蛋白质含量的测定蛋白质含量测定采用李合生9考马斯亮蓝G-250染色法。取0.1ml酶提取液加入0.9ml双蒸水中，再加入5ml考马斯亮蓝混匀，5min后在590nm比色测吸光值。1.2.8 数据分析 实验所得数据采用SPSS软件进行分析，Ecell初步作图。2 结果分析2.1 盐度对无瓣海桑 、拉关木02-产生速率的影响 图2-1 盐度对无瓣海桑、拉关木的02-产生速率的影响 两种红树植物无瓣海桑 、拉关木O2-变化见图2-1，超氧阴离子是生物体受到胁迫后首先生成的氧自由基，可以经过一系列反应生成其他氧自由基，是所有氧自由基的前身。由图2-1可知，无瓣海桑的活性氧在对照时最低，盐处理后呈先上升后降低再上升的趋势，在100mM时显著上升（P0.05)且达到最大；拉关木的活性氧从对照到100mM显著上升（P0.05)，100mM到400mM时呈下降趋势，且在盐度为100mM时达到最大。无瓣海桑和拉关木对照组和400mM时的活性氧差异极显著（P0.05)。2.2 盐度对无瓣海桑、拉关木的抗氧化酶系统的影响 为了避免NaCl 处理产生的氧化胁迫伤害，植物在长期的进化适应过程中形成了一系列的抗氧化酶，如超氧化物歧化酶( SOD) 、过氧化物酶( POD) 、过氧化氢酶( CAT) 、抗坏血酸过氧化物酶( APX)和谷胱甘肽还原酶（GR）等，可清除活性氧，维持活性氧代谢平衡，保护膜的结构和功能10。 图2-2-1 盐度对无瓣海桑、拉关木的SOD酶活性的影响 两种红树植物SOD活性变化如图2-2-1，无瓣海桑盐处理后的SOD活性都比对照高，总体呈上升趋势，在100mM到200mM时显著上升（P0.05)，且在400mM时呈极显著上升（P0.01)水平，达到最大。拉关木盐处理后的SOD活性也都比对照高，在200mM和400mM时都极显著上升(P0.05)，且在400mM达到了最大。拉关木和无瓣海桑在对照和盐处理时SOD活性差异极显著（P0.01),且拉关木的高于无瓣海桑。 图2-2-2 盐度对无瓣海桑、拉关木的APX酶活性的影响 两种红树植物无瓣海桑、拉关木APX活性变化如图2-2-2，无瓣海桑盐处理组100mM和300mM的APX活性比对照组低，200mM和400mM的APX活性显著（P0.05)，且在300mM时达到最大。无瓣海桑和拉关木对照组的APX活性差异显著（P0.05),400mM时两者差异极显著（P0.05)，其中盐度为300mM时活性达到最大。拉关木盐处理200mM的CAT活性低于对照，其他盐浓度的活性均高于对照，且在400mM时显著上升（P0.05),但在100m时两者差异达到了显著水平（P0.05)，400mM时的活性低于对照，在200mM时酶活性达到最大。拉关木盐处理200mM时的GR活性呈最低值，低于对照组,差异不显著(P0.05)；整体趋势是随着盐度的增加，GR活性增强，且在400mM时达到最强。这两种红树 GR酶活性在盐处理后的差异几乎不显著(P0.05)，但在400mM时两者达到了差异显著水平（P0.05)。拉关木盐处理后的POD活性均高于对照组，且在300mM时极显著上升（P0.01)达最高，之后又极显著下降（P0.01)。拉关木在各个处理浓度的POD活性分别是无瓣海桑在各个处理盐度上的6.46倍、4倍、71.12倍、4.95倍，均达到了极显著（P0.01)差异水平。3 讨论3.1 盐处理对无瓣海桑抗氧化酶系统的影响 为了抵御盐胁迫产生的氧化胁迫，植物可通过调节体内的抗氧化酶系统来清除过量的活性氧。植物体内的抗氧化酶系统包括: SOD、CAT、APX 和POD，其中SOD可将O2-转变为H2O2，生成的H2O2被APX、POD 和CAT 分解为H2O 和O2。抗氧化酶体系协同作用，维持植物体内活性氧的代谢平衡，保护膜结构，从而使植物在一定程度上减缓逆境胁迫伤害.研究结果（图2-1和图2-2-1）表明无瓣海桑叶片02-产生的速率在盐处理初期随着盐度的增加而上升，转而下降。其SOD活性在盐胁迫初期呈上升趋势，但随着盐度的增加转而下降。相关分析表明, 超氧负离子的释放速率与SOD 活性的变化趋势呈负相关( r = - 0. 920 ) , 相关方程为y =- 4. 792 7x + 19. 82911.这进一步说明无瓣海桑主要靠SOD清除活性氧自由基和SOD酶基因有“过表达”后“衰退”的现象。APX在盐处理初期有下降趋势，这可能与无瓣海桑盐胁迫的缓冲适应有关。当缓冲期后，APX酶活性上升，且在400mM时达到最高。CAT、POD酶活性在盐处理下与APX有着相类似的变化趋势，这说明盐度超过生理范围，APX、CAT、POD活性增强，从而将无瓣海桑产生的过量H2O2清除，防止了盐胁迫对膜的伤害11。此外，GR酶活性在盐胁迫初期上升，之后下降,但酶活性较CAT、APX、SOD、POD低，这说明GR酶在抗氧化防御方面作用不明显。3.2 盐处理对拉关木抗氧化酶系统的影响 实验结果（图2-1）表明，拉关木叶片02-产生的速率在盐处理初期呈上升趋势，之后又下降，这说明盐处理下对拉关木产生活性氧伤害。其SOD活性在盐度低时变化不明显，但随着盐浓度的增加SOD活性增强。这说明SOD在清除活性氧自由基中起重要作用。POD和APX活性在低盐度时变化不明显，之后上升极显著（P0.01)，然后又下降，且都在300mM时活性达到最大。这说明在低盐胁迫下，POD和APX在清除拉关木产生的过量的O2-和H202清除起重要作用；在高盐度胁迫下，只在短时期内具有保护作用。此外，CAT和GR活性变化趋势类似，都是在低盐度时变化不明显，在200mM时最低且低于对照，而后又上升在400mM时达到最大酶活性。这说明拉关木体内清除活性氧的能力增强，表明了非酶抗氧化剂参与了抗氧化防御反应。3.3 两种红树植物盐处理后抗氧化防御的比较 通过这两种红树植物在抗氧化酶活性的比较可知，拉关木的SOD、GR、POD活性总体都比无瓣海桑高，且差异极显著(P0.05)。由于SOD在清除02-和H202中起主要作用，可认为拉关木的抗氧化防御能力比无瓣海桑强，是耐盐红树育种的首选。4 结论 1.无瓣海桑和拉关木在受到盐胁迫时体内的ROS含量会增加，当ROS积累超过抗氧化系统的清除能力时，ROS就会大量积累，造成抗氧化酶活性的降低和膜通透性的增加。SOD、CAT、POD和APX等保护酶类在植物体内起协同作用，清除过量的活性氧，维持活性的代谢平衡、保护膜结构，从而使植物在一定程度上忍耐、减缓或抵御逆境胁迫伤害。 2.这两种红树植物在中高盐环境下, SOD、POD、CAT 等酶活性的升高, 对活性氧自由基的减少和清除起到非常重要的作用, 它们通过降低O2- 释放速率, 从而降低盐胁迫对质膜的伤害. 3.无瓣海桑的耐盐性稍差，拉关木的抗氧化防御能力较无瓣海桑强，是红树林育种的首选。 致谢 ： 非常感谢我的指导老师李妮亚给予我毕业论文大力的指导和帮助，同时感谢支持和帮助过我的同学！ 参考文献：1 Conn er V J. 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