3b液相色谱法.ppt

4 高效液相色谱法 平时作业 30 文献报告 内容要求 现代分离技术在实际生产和分析检测中的应用新技术或者新应用 体现当前技术进展例超临界流体萃取技术在油脂化工中的应用离子交换树脂在废水处理中的应用至少3页A4纸 纸质版10 25交齐 电子版 小于3M 发至邮箱sampsonzhang12 2 3 4 4 1 1特点 特点 高压 高效 高速 高灵敏度高沸点 热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法 5 4 1 2 流程 6 7 4 1 3 主要部件 1 高压输液泵主要部件之一 压力 150 350 105Pa 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相 10 m 液体的流动相高速通过时 将产生很高的压力 因此高压 高速是高效液相色谱的特点之一 应具有压力平稳 脉冲小 流量稳定可调 耐腐蚀等特性 8 2 梯度淋洗装置 外梯度 利用两台高压输液泵 将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室 混合后进入色谱柱 内梯度 一台高压泵 通过比例调节阀 将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合 9 梯度洗脱 梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度 来调整混合样品中各组分的k值 使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱 它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温 所不同的是 在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性 pH值和离子强度来实现的 而不是借改变温度 温度程序 来达到 10 流路中为高压力工作状态 通常使用耐高压的六通阀进样装置 其结构如图所示 3 进样装置 11 4 高效分离柱 柱体为直型不锈钢管 柱内壁要求精细抛光 内径1 6mm 柱长5 40cm 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效 12 5 液相色谱检测器 a 紫外检测器应用最广 对大部分有机化合物有响应 特点 灵敏度高 线形范围宽 流通池可做的很小 1mm 10mm 容积8 L 对流动相的流速和温度变化不敏感 波长可选 易于操作 可用于梯度洗脱 13 光电二极管阵列 1024个二极管阵列 各检测特定波长 计算机快速处理 三维立体谱图 如图所示 14 c 示差折光检测器 除紫外检测器之外应用最多的检测器 通用型每种物质具有不同的折光指数 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值差值与浓度呈正比 缺点 灵敏度较低 检出下限为10 7g mL 易受温度和流速的影响 不能进行梯度洗脱 15 d 荧光检测器 高灵敏度 高选择性 对多环芳烃 维生素B 黄曲霉素 卟啉类化合物 农药 药物 氨基酸 甾类化合物等有响应 激光诱导荧光 LIF LaserInducedFluorescence体积小 适合毛细管柱 需用衍生法制备衍生物 其衍生法分为柱前与柱后衍生两种 常用邻苯二甲醛或异氰硫基苯为衍生化试剂 16 紫外检测器 荧光检测器 示差折光检测器 17 安培检测器电导检测器库仑检测器介电常数检测器极谱检测器 e 电学和电化学检测器 18 19 1 流动相特性 a 液相色谱的流动相又称为 淋洗液 洗脱剂 流动相组成改变 极性改变 可显著改变组分分离状况 b 亲水性固定液常采用疏水性流动相 即流动相的极性小于固定相的极性 称为正相液液色谱法 极性柱也称正相柱 正相色谱法主要靠组分的极性差别分离 适用于含有不同官能团物质的分离 c 若流动相的极性大于固定液的极性 则称为反相液液色谱 非极性柱也称为反相柱 极性小的组分后出柱 主要分离对象是极性小的物质 6 液相色谱流动相 20 2 流动相类别 按流动相组成分 单组分和多组分 按极性分 极性 弱极性 非极性 按使用方式分 固定组成淋洗和梯度淋洗 常用溶剂 己烷 四氯化碳 甲苯 乙酸乙酯 乙醇 乙腈 水 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性 以改进分离或调整出峰时间 21 3 流动相选择 在选择溶剂时 溶剂的极性是选择的重要依据 采用正相液 液分配分离时 首先选择中等极性溶剂 若组分的保留时间太短 降低溶剂极性 反之增加 也可在低极性溶剂中 逐渐增加其中的极性溶剂 使保留时间缩短 常用溶剂的极性顺序 水 最大 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷 氯仿 溴乙烷 苯 四氯化碳 二硫化碳 环己烷 己烷 煤油 最小 22 4 选择流动相时应注意的几个问题 a 尽量使用高纯度试剂作流动相 防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加 b 避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子 如使固定液溶解流失 酸性溶剂破坏氧化铝固定相等 c 试样在流动相中应有适宜的溶解度 防止产生沉淀并在柱中沉积 d 流动相还应满足检测器的要求 当使用紫外检测器时 流动相不应有紫外吸收 23 4 2 1 液 固吸附色谱liquid solidadsorptionchromatography 固定相 为固体吸附剂 如硅胶 氧化铝等 较常使用的是5 10 m的硅胶吸附剂 流动相 各种不同极性的一元或多元溶剂 基本原理 组分在固定相上的吸附与解吸 适用于分离相对分子质量中等的脂溶性试样 对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性 缺点 非线形等温吸附常引起峰的拖尾 4 2主要分离类型与基本原理 24 有机氯农药残留量分析 固定相 薄壳型硅胶 37 50 m 流动相 正己烷流速 1 5mL min色谱柱 50cm 2 5mm 内径 检测器 示差折光检测器 可对水果 蔬菜中的农药残留量进行分析 25 4 2 2 液 液分配色谱liquid liquidpartitionchromatography 固定相与流动相均为液体 互不相溶 基本原理 组分在固定相和流动相上的分配 流动相 对于亲水性固定液 采用疏水性流动相 即流动相的极性小于固定液的极性 正相normalphase 反之 流动相的极性大于固定液的极性 反相reversephase 正相与反相的出峰顺序相反 常用溶剂的极性顺序 水 最大 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷 氯仿 溴乙烷 苯 四氯化碳 二硫化碳 环己烷 己烷 煤油 最小 26 固定相 早期涂渍固定液 固定液流失 较少采用 液 液分配及离子对分离固定相 1 全多孔型担体由氧化硅 氧化铝 硅藻土等制成的多孔球体 早期采用100 m的大颗粒 表面涂渍固定液 性能不佳已不多见 现采用10 m以下的小颗粒 化学键合制备柱填料 2 表面多孔型担体 薄壳型微珠担体 30 40 m的玻璃微球 表面附着一层厚度为1 2 m的多孔硅胶 表面积小 柱容量底 27 化学键合固定相 目前应用最广 性能最佳的固定相 a 硅氧碳键型 Si O Cb 硅氧硅碳键型 Si O Si Cc 硅碳键型 Si Cd 硅氮键型 Si N稳定 耐水 耐光 耐有机溶剂 应用最广 3 化学键合固定相 将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶 担体 表面的游离羟基上 28 化学键合固定相的特点 1 传质快 表面无深凹陷 比一般液体固定相传质快 2 寿命长 化学键合 无固定液流失 耐流动相冲击 耐水 耐光 耐有机溶剂 稳定 4 选择性好 可键合不同官能团 提高选择性 5 有利于梯度洗脱 存在着双重分离机制 键合基团的覆盖率决定分离机理 高覆盖率 分配为主 低覆盖率 吸附为主 29 稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质 固定相 十八烷基硅烷化键合相流动相 20 甲醇 水 100 甲醇线性梯度淋洗 2 min流速 1mL min柱温 50 C柱压 70 104Pa检测器 紫外检测器 30 分离的方式 离子排斥 离解常数和疏水性离子对 RP 对离子对试剂的亲和力离子对化合物的疏水性离子抑制 RP 在特定pH下的疏水性反相 疏水性 离子交换 离子价态和离子半径 4 2 3离子色谱 离子交换色谱ion exchangechromatography 固定相 阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂 流动相 阴离子离子交换树脂作固定相 采用酸性水溶液 阳离子离子交换树脂作固定相 采用碱性水溶液 基本原理 组分在固定相上发生的反复离子交换反应 组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径 电荷 存在形式等有关 亲和力大 保留时间长 阳离子交换 R SO3H M R SO3M H 阴离子交换 R NR4OH X R NR4X OH 应用 离子及可离解的化合物 氨基酸 核酸等 32 Temporalcourse 离子交换分离机理 4 2 3离子色谱 阴离子交换树脂 乳胶型 m 4 2 3离子色谱 阳离子交换树脂 接枝型 4 2 3离子色谱 分离阴离子 Column IonPacAG12A AS12AEluent 2 7mMNa2CO30 3mMNaHCO3Flowrate 1 2mL minDetection Conductivity ASRSRecyclemode 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Retentiontime min 0 8 mS 4 2 3离子色谱 Column IonPacCS12A CG12AEluent 20mMMethanesulfonicacidFlowrate 1 0mL minDetection Conductivity CSRSRecyclemode 分离阳离子 0 2 4 6 8 10 12 14 Retentiontime min 0 1 2 3 4 S 4 2 3离子色谱 离子排斥法分离机理 Donnanmembrane 固定相 流动相 4 2 3离子色谱 离子排斥色谱法的分离机理 1 Donnan排斥作用 Donnan膜的负电荷层排斥完全离解的离子型化合物 仅允许未离解的化合物通过2 吸附 保留时间与有机酸的烷基键的长度有关 通常烷基键越长 其保留时间也越长 3 空间排阻 与有机酸的分子量大小及交换树脂的交联度有关 4 2 3离子色谱 Column IonPacICEAS1Eluent 0 4mMOctonesulfonicacidFlowrate 1 0mL minSuppressor AMMS ICE Regeneratorliquid 5mMTBAOH 50mMH3BO3Detection Conductivity 离子排斥法分离有机酸 20 10 0 保留时间 min 0 S 5 1 2 3 4 5 1 甲酸2 乙酸3 丙酸4 丁酸5 戊酸 4 2 3离子色谱 离子对色谱ionpairchromatography 原理 将一种 或多种 与溶质离子电荷相反的离子 对离子或反离子 加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物 使其能够在两相之间进行分配 阴离子分离 常采用烷基铵类 如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子 阳离子分离 常采用烷基磺酸类 如己烷磺酸钠作为对离子 反相离子对色谱 非极性的疏水固定相 C 18柱 含有阳离子Y 的甲醇 水或乙腈 水作为流动相 试样离子X 进入流动相后 生成疏水性离子对Y X 后 在两相间分配 41 MobilephaseTBAOH ACN H2OSampleY X 固定相 TBA OH Y X Y X TBA X TBA X TBA X TBA X TBA OH ACN ACN ACN ACN ACN ACN ACN TBA OH TBA OH 疏水相 亲水相 反相离子对分离机理 Y OH 4 2 3离子色谱 反相离子对的分离机理 1 生成离子对 待测离子与离子对试剂生成中性 离子对 分布于固定相与流动相之间 其分离类似传统的反相分离2 动态离子交换 离子对试剂的疏水部分吸附于固定相形成动态的离子交换表面 其分离机理类似于离子交换 3 离子间相互作用 除包括以上两种分离机理和固定相表面双电层结构的分离机理 4 2 3离子色谱 Column IonPacNS1 NG1Eluent 2mMTBAOH 24 48 CANgradientin10minFlowrate 1 0mL minDetection Conductivity suppressortype ASRSMPICMode Regenerator 10mNH2SO41 Methanesulfonicacid5 0 g mL ppm 2 1 Propanesulfonicacid8 63 1 Butanesulfonicacid8 74 1 Hexanesulfonicacid8 85 1 Heptanesulfonicacid8 96 1 Octanesulfonicacid8 97 1 Decanesulfonicacid9 1 0 Retentiontime min 12 16 8 S 0 0 4 8 0 反相离子对分离测定 4 2 3离子色谱 4 2 4 尺寸排斥色谱size exclusionchromatography 原理 按分子大小分离 小分子可以扩散到凝胶空隙 由其中通过 出峰最慢 中等分子只能通过部分凝胶空隙 中速通过 而大分子被排斥在外 出峰最快 溶剂分子小 故在最后出峰 全部在死体积前出峰 可对相对分子质量在100 105范围内的化合物按质量分离 45 M W tR 46 M W tR 47 M W tR 48 M W tR 49 4 2 5 亲和色谱Affinitychromatograph 原理 利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力 进行选择性分离 先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂 环氧 联胺等 再连接上配基 酶 抗原等 这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留 改变淋洗液后洗脱 50 1 概述超临界流体 在高于临界压力与临界温度时 物质的一种状态 性质介于液体和气体之间 超临界流体色谱 SFC 80年代快速发展 具有液相 气相色谱不具有的优点 1 可处理高沸点 不挥发试样 2 比LC有更高的柱效和分离效率 4 3超临界色谱 SFC SupercriticalFluidChromatograph 51 2 超临界流体性质 1 性质介于液体和气体之间 具有气体的低黏度 液体的高密度 扩散系数位于两者之间 2 可通过改变超临界流体的密度 程序改变 调节组分分离 类似于气相色谱的程序升温 液相色谱中的梯度淋洗 超临界流体的密度与压力有关 52 3 原理 SFC的流动相 超临界流体 CO2 N2O NH3SFC的固定相 固体吸附剂 硅胶 或键合到载体 或毛细管壁 上的高聚物 可使用液相色谱的柱填料 填充柱SFC和毛细管柱SFC 分离机理 吸附与脱附 组分在两相间的分配系数不同而被分离 通过调节流动相的压力 调节流动相的密度 调整组分保留值 53 程序升压 54 1 结构流程 55 2 主要部件 1 SFC的高压泵无脉冲的注射泵 通过电子压力传感器和流量检测器 计算机控制流动相的密度和流量 2 SFC的色谱柱和固定相可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱 SFC的固定相 固体吸附剂 硅胶 或键合到载体 或毛细管壁 上的高聚物 专用的毛细管柱SFC 56 3 流动相SFC的流动相 超临界流体 CO2 N2O NH3CO2应用最广泛 无色 无味 无毒 易得 对各类有机物溶解性好 在紫外光区无吸收 缺点 极性太弱 加少量甲醇等改性 4 检测器可采用液相色谱检测器 也可采用气相色谱的FID检测器 57 HPLC分离方法的选择依据 58 4 4高效液相色谱的实验技术 一 柱技术液相色谱柱是色谱的关键部件 应该了解柱子结构 填料性质 装柱操作和保养维持技术 1 装填 用 高压匀浆法 装填 1 装柱机的准备高压匀浆法装柱的装填机及配套流程见图 色谱柱的高压匀浆法装填 59 2 柱子的清洗 有两种清洗法可供选择 一是有机溶剂清洗法 柱子依次用二氯甲烷 丙酮 水洗洗干净 二是酸洗法 把柱头及柱管放在1 1的硝酸中超声20 30min 再用清水超声处理几次 至洗涤的水显中性 3 装柱条件的选择 装柱条件主要是装柱压力 是使用压力的几倍 装柱时间 在20 60min之间 匀浆的体积 随机附有匀浆管 等 4 匀浆的配制 装柱的填料要用一定的溶剂使其分散制成匀浆 装反相色谱柱常用四氯化碳和二氧六环 约2 1 装流动相是盐水溶液的填料可用异丙醇 60 方法 先称取所需填料量的1 1 1 2倍 加入与匀浆管体积数相等量的分散溶剂 超声2 3min 使填料分散均匀 并尽可能地赶去填料孔内气泡 将清洗过的柱子一头柱头装好 另一头柱头卸下 将柱子装在匀浆管上 然后将匀浆从超声器上取出倒进匀浆管 此时 匀浆应充满整个匀浆管 接上管子后马上开泵装柱 5 装柱 装柱过程中不能停顿 以免装填不匀 方法 装柱时间到了以后 不能马上拆下柱子 应关阀门 然后等待5 20min 让柱内压力自然降低 柱子出口不再滴液时方可拆下柱子 装上柱头 并拧上两头的密封螺丝 61 2 柱子的保养 柱子不用时 用不会长霉菌的液体充满柱内 并拧紧两头密封螺丝 常用的封存液有 甲醇 50 甲醇 万分之二的叠氮化钠水溶液 3 柱子堵塞的处理柱子堵塞经常是柱子入口端筛板被杂质堵塞 可以拆下入口端柱头 用可以溶解杂质的溶剂超声或煮沸处理 也可以用1 1的HNO3煮30min 4 柱子填料凹陷打开柱头 用同种填料在湿润下填平即可 62 二 洗脱方式 洗脱方式有三种 等浓度洗脱 梯度洗脱 脉冲洗脱 等浓度洗脱 是流动组成 pH值 流速不变化的洗脱方式 使用示差检测器时 or在排阻色谱中 只能使用等浓度洗脱 梯度洗脱 在一次分离中用改变流动相组成或pH来逐步增加流动相洗脱能力的洗脱方式 梯度洗脱用两种洗脱液 分A液和B液 A液洗脱能力弱 B液洗脱能力强 洗脱开始时用A液 然后根据梯度洗脱程序自动向流动相中添加B液 增大洗脱强度 使用紫外检测器和荧光检测器时的反相色谱和离子交换色谱中可以使用梯度洗脱 一般 在样品组分较多 组分之间容量因子K 或保留时间相差大时 应该使用梯度洗脱 否则保留强的溶质峰太宽或者某些峰分离不开 脉冲洗脱 用一段少量的洗涤剂 让它象一条密集的脉冲带流过柱子 以洗下某个特定物质 这种方法适用于很昂贵洗脱液 须在柱子平衡 上样 洗涤后使用 亲合色谱中使用 63 三 流动相的处理 流动相若不纯 则要作纯化处理 方法 水要用去离子水或蒸馏水 有机溶剂常要先作化学处理后重蒸 盐要重结晶除去一些有害的重金属离子 配制好的流动相应作过滤和脱气处理 过滤时用孔径0 2 m的膜 除去机械杂质 脱气处理有超声 抽真空 回流三种方法 以除去溶液中的气体 国外还常用He气 使流动相的瓶中保持一定的He气分压作为脱气的一种手段 因代价高 国内不常用 64 4 5高效液相色谱的应用一 制备分离用HPLC进行制备分离 其性能远比气相色谱优越 可用于制备纯品 只分离不分析 或气相色谱的前处理 HPLC GC联用 使用内径为8mm的色谱柱 可制备mg级纯品 用于结构测定 也可作为HPLC纯的试剂 为GC提供标样 65 1 制备色谱分类 66 2 分析型和制备型色谱的差别 分离样品量不同 分析型不超过1mg 制备型至少进样几毫克以上 柱子大小及仪器不同 制备 用大柱子和制备色谱仪 分离目的 要求不同 色谱分离三个指标 即分离度 分离速度和样品负荷量 这三者是互相关联的 分型型色谱中 在极短的时间内得到高分离度 不考虑分离量 因为其目的是要得到样品的组成及含量的数据 制备色谱中 目的 得到纯度高的某物质 并且往往要求尽可能地减少成本 要求 分离度是以保证纯度为标准 分离量在保证纯度的情况下越大越好 67 分析型色谱 线性色谱 柱子不过载 样品组分的保留值 K 和柱效 不随样品量的变化而改变 K 与流动相相流速无关 分离度 Rs 和塔板数 n 与流速有关 峰形与样品量无关 但峰面积与样品量成正比 制备色谱 有两种情况 一是柱子不过载 与分析型色谱有类似的现象 二是柱子过载 这就是非线性色谱 在柱子过载后 K n随样品量的变化而变化 样品量增大 K 减小 n增大 流速对分离度和塔板数的影响较小 分析型色谱不收集组分洗脱液 制备色谱中要收集有关产品的洗脱液 68 二 样品前处理HPLC色谱柱的柱头易被污染 被测样品一定要严格进行前处理 提取后一般用薄层色谱或柱色谱进行预分离 再用预处理柱进一步去杂质 HPLC一般不需要制备衍生物 但 1 为使样品中的各组分能被检测器检出 需制备衍生物 例如 分析脂肪酸或氨基酸时 若用UVD检测器 要用对硝基苯甲酰氯与试样反应 生成酯类化合物 使其在紫外光下有吸收 2 对不易分离的强极性有机物 例如脱落酸 可进行酯化 以提高分离效果 69 1 HPLC在不同领域的主要应用 三 HPLC的应用及实例 70 HPLC在几方面的应用 1 蛋白质和氨基酸 蛋白质样品 提取 纯化 蛋白质分析专用柱 磷酸盐缓冲液作流动相 紫外检测器 210nm 分离 例 用Waters1 125蛋白柱 分离出7种相对分子质量不同的蛋白质 铁蛋白 M 540000 牛血清蛋白 M 67000 蛋清蛋白 M 45000 肌红蛋白 M 17000 核糖核酸酶 M 13700 细胞色素 M 12500 鸟苷 M 283 71 氨基酸用离子交换色谱或反相色谱 脱脂样品20 30mg 含蛋白质3 5mg 加6M盐酸8ml于110 水解22h 浓缩 离心 离子交换柱 不同pH的磷酸缓冲液洗脱 用水合茚三酮制备衍生物 比色仪 570和444nm 检测 最小检测量 100pmoles 微微摩尔 例 LKB4150氨基酸分析仪90min内完成一个样品的18种氨基酸分析 离心后也可用C 18反相柱 乙腈 乙酸乙酯 甲醇梯度洗脱 用邻苯二甲醛制备衍生物 紫外检测器检测 72 预处理样品 PICO TAGTM水解器水解 用异硫氰酸苯制备衍生物 PICO TAGTM柱 反相分配梯度洗脱 紫外检测器 254nm 检测 最小检测量 1pmole 例 Waters PICO TAG氨基酸分析仪12min内完成一个样品的18种氨基酸分析 73 2 萜类从单萜到四萜均可用HPLC分析 特别适合于含氧 含氮的二 三萜 正相柱硅胶柱 YWG 流动相 己烷或庚烷 二氯甲烷 乙酸乙酯 用己烷或庚烷作底剂 用二氯甲烷 乙酸乙酯调节极性 加到底剂中 反相柱YWG C18 流动相 甲醇 水检测器 含共轭双键的化合物用紫外检测器 其它用示差折光检测器或蒸发光散射检测器 74 3 甾体 生物碱和糖类分析甾体 生物碱和糖类 HPLC优于GC 甾体固定相 YWG C18 流动相 乙腈 水 检测器 紫外 生物碱固定相 YWG C18 流动相 甲醇 水 以此控制生物碱对离子的亲合能力 达到分离目的 调节出峰次序 检测器 紫外 75 糖类固定相 YWG NH2或糖类专用柱 流动相 乙腈 水 固定相 阳离子交换树脂类凝胶 流动相 水 检测器 折光或蒸发光散射检测器 4 维生素用HPLC测定维生素具有其它方法无可比拟的优点 即能同时测定多种维生素 而且快速 灵敏 因而在农林业中应用最为广泛 植物中的维生素有水溶性和脂溶性两大类 前者包括 维生素C B1 B2 B6 B12 叶酸 烟酸等 后者包括 维生素A1 A2 D2 D3 E K等 76 VC果蔬 食品等样品 5 10g 6 H3PO450ml 或pH 2 5NaAc Hac缓冲液 H3PO3 捣碎 混匀 过滤 SEP PAKC18柱净化 测定 固定相 Bond PAKC18 流动相 pH 4 6的0 0025M NH4 H2PO4 检测器 紫外 254nm 脂溶性维生素样品 乙醚或石油醚 丙酮 正己烷等提取 清液除甾醇等能皂化的组分 抗氧化剂 用5 KOH 乙醇溶液皂化 石油醚或乙醚萃取 有机相用SEP PAKC18柱净化 浓缩 测定 固定相 Bond PAKC18或 Bond PAKNH2 流动相 甲醇 水 95 5 检测器 紫外或荧光 77 B1 B2干样粉2 5g 50ml棕色容量瓶 30ml0 1MHCl溶液 100 煮沸30min 冷却 3 淀粉酶和木瓜酶的混合液 37 酶解 过夜 定容 B2 用SEP PAKC18柱净化B1 pH 7 8 铁氰化钾氧化 异丁醇萃取 用SEP PAKC18柱净化 测定 固定相 Bond PAKC18 流动相 pH 7 8的0 05M磷酸盐缓冲液 乙腈 82 18 检测器 荧光 78 在食品分析中的应用 一 糖类的分离分析1 食品中糖含量是产品质量控制的 个指标 糖类可分为单糖 寡糖和多糖 它们可使用离子交换柱或胺基键合相柱进行分离 图为在胺基键合相柱分离单糖的谱图 色谱柱胺丙基硅胶柱 5um 4 6mm 250mm 流动相75 乙腈水溶液 流量为2 0mL min 检测器 UVD 188nm 79 1 溶剂 2 鼠李糖 3 木糖 4 阿拉伯糖 5 果糖 6 甘露糖 7 葡萄糖 8 半乳糖 80 二 有机酸及酸味剂的分离分析1 食品中的有机酸和酸味剂 Acidulants 是食品酸味和鲜味的重要成分 也对食品的防腐保鲜起重要作用 图为咖啡酸及其衍生物的反相键合相色谱分离图 色谱柱 LichrosorbSI 100 C18 10um 4 2mm 300mm 流动相 20 乙酸水溶液 流量为4 5mL min检测器 UVD 254nm 81 1 奎宁酸 2 绿原酸 3 咖啡酸 4 对香豆酸 5 间香豆酸 6 邻香豆酸 7 香豆素 咖啡酸及其衍生物的反相键合相色谱分离图 82 三 维生素的分离分析维生素种类很多 在化学结构上并无共性 它们可为胺类 VB1 醛类 VB6 或醇类 VA 根据其物理性质可分为水溶性维生素 如Vc VB1 VB2 和油溶性维生素 如VA VD VE 两大类 用反相离子对色谱分离水溶性维生素如下图所示 色谱柱为BiophaseODS 5um 4 6mm 250mm 流动相 A 1 乙酸 0 5 三乙胺溶液 pH 4 5 B A 甲醇 50 50 梯度洗脱程序在0 10min内 流动相B由0增至80 再维持15min 流量为lmL min 用UVD 275nm 检测 83 1一维生素C 2一维生素B1 3一维生素B6 4 烟酸 5一维生素K3 亚硫酸氢钠甲基奈醌 6 烟酰胺 7一对羟基苯甲酸 8一维生素Bl2 9 维生素B2 用反相离子对色谱分离水溶性维生素谱图 84 油溶性维生素可用反相键合相柱分离 见右图 色谱柱为PermaphaseODS 30um 2 1mm 1000mm 流动相A为H2O B为CH3OH 梯度程序是B以5 min的梯度增加 流量为2mL min 柱温70 用UVD 254nm 检测 1 维生素K 2 维生素A乙酸酯 3 维生素D2 4 维生素E 5 维生素E乙酸酯 6 维生素A 85 思考题 HPLC中 紫外检测器与折光检测器各有什么特点 对不同物质紫外检测波长如何选 按分离机理分 HPLC有多少种方法 如何根据样品性质选择柱子和流动相 梯度洗脱作用两性离解的物质 如蛋白质 其pI的值与选择柱子和流动相的pH有什么关系 pI与pH值对tR有什么影响 反相色谱中 出峰的先后顺序与组分的性质有何关系 什么是线性色谱 什么是非线性色谱 86 87 气相色谱法与高效液相色谱法的异同点 1 流动相GC 流动相为惰性 气体组分与流动相无亲合作用力 只与固定相有相互作用 HPLC 流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力 能提高柱的选择性 改善分离度 对分离起正向作用 且流动相种类较多 选择余地广 改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用 当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性 2 分类 按固定相不同 GC中 按固定相不同可分为 气 固色谱法 气 液色谱法 HPLC中 按固定相不同可分为 液 固色谱法 液 液色谱法 3 固定相气固 液固 色谱的固定相 多孔性的固体吸附剂颗粒 如活性炭 活性氧化铝 硅胶等 气液 液液 色谱的固定相 化学惰性的固体微粒 担体 固定液 担体 88 5 应用范围GC 适于能气化 热稳定性好 且沸点较低的样品 但对高沸点 挥发性差 热稳定性差 离子型及高聚物的样品 尤其对大多数生化样品不可检测占有机物的20 HPLC 适于溶解后能制成溶液的样品 包括有机介质溶液 不受样品挥发性和热稳定性的限制 对分子量大 难气化 热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测用途广泛 占有机物的80 4 特点GC 高效能 选择性好 灵敏度高 操作简单 HPLC 高压 高速 高效 高灵敏度 89 6 分离机理 1 GC GC一种物理的分离方法 利用被测物质各组分在不同两相间分配系数 溶解度 的微小差