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动物细胞工程复习题1、 动物细胞培养相关概念（原代培养、传代培养、细胞株、接触抑制）原代培养：指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。传代培养：当细胞持续生长增殖到一段时间达到一定的细胞密度后，就应当将细胞分离到新的培养器皿并补充新的培养液进行培养，即为。细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得到的由单一类型的细胞群体建立的亚系称为细胞株。接触抑制：细胞相互接触后，如果培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称为。2、 简述动物细胞体外培养的一般条件。1、无菌、无毒的环境：首先应保证被培养的细胞处于无菌、无毒的环境，即对培养液和所有的培养用具进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素以防培养过程中的污染。2、营养物质：细胞体外培养所需营养物质与体内基本相同，需要有葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常还需加入血清、血浆等一些天然成分。3、温度和pH：细胞体外培养的适宜温度一般与动物的体温相近。多数细胞生存的适宜pH为7.27.4。4、气体环境：细胞培养所需气体主要有O2和CO2，O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，将其置于含95%空气加5% CO2的混合气体的培养箱中进行培养。3、 什么是无血清培养基?有哪两部分组成？无血清培养基是全部用已知成分组配的不含血清的合成培养基。基础培养基+促细胞生长因子4、体外培养动物细胞的生长方式，类型。生长方式可分为：贴附型生长细胞和悬浮型生长细胞5、 体外培养细胞寿命的过程，一代细胞的生长过程。原代培养期、传代期、衰退期潜伏期、对数生长期、稳定期、衰亡期6、 动物细胞大规模培养的方法。1、 转瓶培养2、 反应器贴壁培养3、 悬浮培养4、 固定化培养（1）微载体培养系统（2）中空纤维培养系统（3）微囊培养系统7、 培养细胞的常规检查项目有哪些，怎样对培养细胞进行生物学鉴定。1、 培养液和pH检查2、 细胞生长情况分析3、 培养细胞的污染检测和排除（1） 污染途径（2） 污染对培养细胞的影响及污染的检测（3） 污染的防治（4） 污染的排除8、 举例说明细胞建系过程（教材260）。9、 试述单克隆抗体制备过程。（1）细胞准备：将抗原注射入小鼠体内，从小鼠脾脏中获得能产生抗体的B淋巴细胞。 实验室培养小鼠骨髓瘤细胞。（2）细胞融合：促溶剂：电激、聚乙二醇或灭活的仙台病毒。 融合细胞的种类：三种。（3）细胞培养：利用动物细胞培养技术培养融合后的细胞。（4）第一次筛选：筛选出杂交瘤细胞。（5）第二次筛选：筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。（6）扩大培养：体外培养：从细胞培养液中提取单克隆抗体。 体内培养：从小鼠腹水中提取单克隆抗体。10、名词解释胚胎移植：指对优秀雌性动物进行超数排卵处理，在其发情配种后一定时间内从其生殖道取出早期胚胎，移植到同期发情的普通雌性动物生殖道的相应部位，让其产生后代的技术。超数排卵：在动物发情周期的适当时期，用促性腺激素进行处理，诱发其卵巢上大量卵泡同时发育并排卵的技术。同期发情：就是利用某些激素制剂人为地控制并调整受体发情周期的进程，使供体与受体在发情的时间上相同或相近。胚胎冷冻：将胚胎保存于低温或超低温的情况下，是细胞处于新陈代谢和分裂速度减慢或停止的状态，一旦恢复正常发育温度时，又能继续发育。11、 超数排卵常用的激素促性性腺激素：促卵泡素（FSH）、促黄体素(LH)、孕马血清促性腺激素(PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促排卵3号(LRH-A3)孕激素：孕酮前列腺素(PG)12、 胚胎移植的原则(1)胚胎移植前后所处环境的一致性。指胚胎移植后的生活环境与胚胎的发育阶段相适应，具体包括以下几个方面。一是供体和受体种属上的一致性。二是生理上的一致性。即受体母畜和供体母畜在发情时间上的同期性。三是胚胎收集和移植部位的一致性。即从供体输卵管内收集到的胚胎应该移植到受体的输卵管内，从供体子宫内收集到的胚胎应该移植到受体的子宫内。 胚胎发育的期限。从生理学的角度讲，胚胎收集和移植的期限不能超过周期黄体的寿命，最迟要在周期黄体退化之前数日以及胚胎附植之前进行。因此，胚胎收集多在发情配种后的38天内进行，受体在相同的时间内接受胚胎移植。 胚胎的质量。在胚胎移植的操作过程中，胚胎不应当受到任何不良因素(物理的、化学的、生物的)的影响，移植的胚胎须经过鉴定确认是发育正常的。13、 简述胚胎移植的方法、程序及操作方法程序：供体和受体的选择，供体的超数排卵处理，受体的同期发情处理，胚胎回收，胚胎检查及质量鉴定，胚胎移植。（一）牛的胚胎移植1、手术移植先将受体母牛做好术前准备。在右腹部切口，找到有黄体侧子宫角，再把吸有胚胎的注射器或移卵管刺入子宫角前端，注入胚胎，然后将子宫复位，缝合切口2、非手术移植（1）、非手术移植一般在发情后第69天进行，过早移植会影响受胚率。（2）、在非手术移植中采用胚胎移植枪和0.25mL细管移植的效果较好。（3）、将装有胚胎的吸管装入移植枪内，通过子宫颈插入子宫角深部，注入胚胎。（4）、非手术移植要严格遵守无菌操作规程，以防生产殖道感染（二）羊的胚胎移植1、常规手术法 对受体羊进行常规手术，在乳房前的腹中线部做一切口，然后引出输卵管或子宫角。 通常将发育在3.5天内的胚胎移入输卵管，发育到3.5天以后的胚胎移入子宫角。 胚胎一般应移入有黄体一侧的子宫角内2、简易手术法 用手术刀在母羊后肢内侧的鼠蹊部做1.21.5cm的切口，插入食指，找到子宫角，插入手术刀柄，用食指和手术刀柄夹出子宫角，然后用移植针进行移植。3、非手术法 用阴道扩张器，将移植导管通过子宫插入到子宫角植入胚胎。此法尚不可靠，成功率低。4、腹腔镜法 先对羊进行全身麻醉，而后从腹部插入腹腔镜，用特制的镊子夹住子宫角，并将其轻轻提起，然后将胚胎注入子宫角。14、 简述胚胎的质量鉴定与分级方法质量鉴定形态学鉴定：在50160倍的生物显微镜下对胚胎质量进行综合评定。染色检查;(1) 荧光染色检查：二乙酸荧光素，在荧光显微镜下，活力越强的细胞显示出淡绿色的荧光越强，死亡的细胞不发荧光。(2) 台盼蓝染色检查：有活力的细胞不着色，死亡的细胞充满着台盼蓝着色颗粒。体外培养法：把被鉴定的胚胎在一定条件下进行体外培养。分级方法A级（优秀胚）：形态正常，卵裂球之谜，整齐、清晰，无游离的细胞和液泡；B级（良好胚）：卵裂球稍微不匀，比较致密、整齐，可见一些游离的细胞核液泡；C级（一般胚）：卵裂球不匀称，变形，发育较慢，游离的细胞或液泡较多；D级（不良胚）：卵裂球多数变形、异常，发育缓慢；15、 常用的胚胎采集方法有哪些手术回收与非手术回收16、 常用的胚胎冷冻方法有哪些，之间有什么区别（冷冻液一般是1.4mol/L甘油和PBS）1、 常规冷冻法：需专用冷冻仪2、 一步冷冻法：利用高浓度的抗冻剂是胚胎在冷冻前脱水3、 玻璃化法：玻璃化溶液的组成是25%甘油，25%乙二醇这几种方法的具体操作不同17、 冷冻胚胎的质量如何判定？1、 形态学鉴定：胚胎解冻后在实体显微镜下观察2、 染色检查：解冻后，荧光染色检查和台盼蓝染色检查（见14题）3、 培养鉴定：解冻后，体外培养：在37度下培养612h；异体培养：胚胎置于结扎的兔 输卵管内，1224h，再从输卵管冲出，检查发育情况。4、 移植检查：将解冻后的胚胎移植给受体动物，根据受体的妊娠率和产仔率计算胚胎的存活率（最直接可靠的检验方法）18、 按照细胞发育潜能将干细胞可分为几类，根据细胞来源可分为几类按分化潜能，分为全能干细胞，三胚层多能干细胞，单胚层多能干细胞，单能干细胞；根据来源，分为胚胎性干细胞和成体干细胞；19、 试述ES细胞和成体干细胞的特点ES细胞：ES细胞一般是从发育早期的胚胎内细胞团中分离培养出来的一种具有自我更新、无限增殖能力、能分化成代表3个胚层组织细胞能力的干细胞，细胞直径为1215微米，细胞集落特征明显。 成体干细胞：成体干细胞的来源很多，包括造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞及表皮干细胞。成体干细胞具有分化成其他细胞或组织的潜能，大部分可以分化为至少2或3种以上其他的组织细胞。成体干细胞含量极微，很难分离和纯化，且数量随年龄增长而降低。20、 一般用MEF和STO作为饲养层细胞的原因是什么，简述MEF饲养层制备过程MEF（小鼠胚胎成纤维细胞）：能产生抑制胚胎性干细胞自主分化的白血病抑制因子（LIF）和促进胚胎干细胞增殖的细胞因子；STO细胞：分泌干细胞生长因子（SCGF）和白血病抑制因子（LIF）；制备过程：取妊娠1214天的母树，处死无菌取胎儿，去除头、四肢、内脏、尾，用剪刀剪碎，加入适量0.25%胰酶和0.04%EDTA消化液，作用10-15min，细胞离散后，1000r/min离心5min，用细胞培养液吧细胞制成悬液。调整细胞浓度接种在细胞培养皿中，培养。 选取生长旺盛的培养皿，加入有丝分裂抑制剂丝裂霉素C。完全处理丝裂霉素，再用0.25%胰酶和0.04%EDTA消化液消化制成单细胞悬液。在用明胶预处理过的6孔培养板中每孔加入0.6ml细胞悬液，培养，使用前要更换成胚胎干细胞培养液。21、 干细胞有什么基本特征，有何意义自我更新和多向分化潜能是干细胞的基本特征，具体特点有：（1）具有自我更新能力（2）能无限地或较长期的分裂、增殖，但分裂周期较慢，可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。（3）在机体内的数目、位置相对恒定，但随着年龄的增长，数量可能逐渐减少。（4）属非终末分化细胞，终身保持未分化或低分化状态。（5）通过两种方式生长，一种是对称分裂，形成两个相同的干细胞，另一种是不对称分裂，子代两个细胞中一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保存下来，另一个不可逆地走向分化的终端成为功能专一的成熟细胞。（6）具有多向分化潜能，能分化为各种不同类型的组织细胞，其分化受多种内在机制和微环境因素的影响。可用来建立哺乳动物发育的体外模型；生产转基因动物；进行基因和细胞治疗；进行器官培养。22、 试以小鼠ES细胞为例，简述干细胞的分离、纯化和培养过程23、 ES细胞的鉴定方法有哪些，依据是什么1、 形态学特征2、 特异性标志分子的表达（1） Oct-4（2） 碱性磷酸酶（AKP）：未分化的ES细胞表面标记AKP呈强阳性，分化为阴性；（3） 阶段特异性胚胎细胞表面抗原（SSEA）：在未分化多能干细胞中SSEA常为阳性；（4） ESX细胞的端粒酶活性：分化程度越高，活性越低；（5） 其他表面标志分子3、 分化潜能的检测（1）体外分化潜能检测（2）体内分化潜能检测4、 嵌合体的形成鉴定细胞是否具有多能性5、核型的检测24、 试述干细胞的应用前景及存在问题同胚胎干细胞相比，成人身体上的干细胞只能发育成20多种组织器官，而胚胎干细胞则能发育成几乎所有的组织器官。但是，如果从胚胎中提取干细胞，胚胎就会死亡。因此，伦理道理问题就成为当前胚胎干细胞研究的最大问题之一。1、目前，常用的植物细胞培养基种类有哪些？各有什么特点？1）MS培养基 特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的平衡溶液。2）B5培养基 其主要特点是含有较低的铵，这是因为铵对不少培养物的生长有抑制作用。3）White培养基 其特点是无机盐数量较低，适于生根培养4）N6培养基 其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。5）KM8P培养基 其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合培养。2、简要说明MS培养基的基本组成。1）大量元素母液配制 MS培养基的大量元素主要包括硝酸铵（NH4NO3）、硝酸钾(KNO3)、磷酸二氢钾（KH2PO4）、硫酸镁（MgSO47H2O）和氯化钾（CaCl2,CaCl22H2O）五种化合物。2）微量元素母液配制 MS培养基的微量元素由7种化合物（除Fe外）组成MnSO44H2O、ZnSO47H2O、H3BO3、KI、NaMoO42H2O、CuSO45H2O、CoCl26H2O。3）铁盐母液配制 MS培养基中的铁盐是硫酸亚铁（FeSO44H2O）和乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）的螯合物，必须单独配成母液。4）有机母液的配制 MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、烟酸硫胺素和盐酸吡哆素。5）激素母液配制 MS培养基中的激素有生长素类、细胞分裂素3、配制培养基时，为什么要先配制母液？如何配制母液？1）配制母液不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。2）基本培养基中的大量元素、微量元素、维生素等一般都分别配制成母液。4、常用的灭菌方法有哪些，各有哪些优缺点？1）湿热灭菌（高压蒸汽灭菌） 优点：高