分子生物学技术在动物繁殖中的应用.doc

分子生物学技术在动物繁殖中的应用岳耀敬，郭宪，焦硕，杨博辉，郭建（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州730050）摘要：RNA干扰(RNAi)和基因芯片技术是近年兴起的重要的分子生物学技术。作者介绍了RNA干扰和基因芯片的概念、分类、及其在动物繁殖中的应用，并就这两项分子生物学技术在未来繁殖学中的应用进行了展望。随着RNAi和基因芯片技术的不断发展完善,必将在动物繁殖生产实践中发挥巨大的作用。关键词：RNA干扰；基因芯片；动物繁殖动物繁殖技术是生物技术的重要组成部分，是以动物生殖细胞和胚胎为主要研究对象，以生物科学为基础，研究调控和提高动物繁殖性能、发掘动物繁殖潜能。动物繁殖是动物生产中的关键环节，对动物数量的增加和质量的提高具有重要作用。随着科学技术的发展，动物繁殖技术的研究不断深入，应用范围日益广泛。动物繁殖技术从20世纪50年代的人工授精到70年代的胚胎移植的应用，开始了新纪元。常规人工授精和胚胎移植、性别控制等一系列高新技术的应用使得动物繁殖的速度更快、生产性能更高、准确性更好，给畜牧业带来了巨大的经济效益和社会效益，为其产业化发展提供了强大的动力和竞争力。另外，分子生物学的某些突破使人们能够分离基因，并在体外进行重组。这些突破迎来了动物繁殖技术发展的新时代。本文主要阐述了RNA干扰(RNAinterference,RNAi)，基因芯片等几个方面的动物繁殖技术应用进展。1RNA干扰RNA干扰现象属于转录后水平基因沉(post2transcriptionalgenesilence,PTGS),是指一些小分子双链RNA(doublestrandRNA,dsRNA)通过特异性降解与其同源的mRNA,而在mRNA水平上高效阻断体内特异性基因表达的现象。RNAi广泛存在于真菌、高等植物、无脊椎动物和哺乳动物中,是自然界中客观存在的进化保守防御机制,在维持基因稳定、保护基因组免受外源核酸侵入、基因表达调控等方面发挥重要生物学作用。自1998年美国卡耐基研究院Fire等报道在秀丽新小杆线虫(Caenorhabditiselegans)中低剂量的双链RNA可有效调节基因表达现象,并提出RNAi概念以来,RNAi现象引起特别重视,对其的研究也越来越深入。2002年,Science杂志将这一发现评为该年度世界十大科学成就之首,最近公布,该现象发现者荣获2006年度诺贝尔生理学或医学奖,对RNAi的研究和应用已逐渐成为分子生物学领域的热点。1.1RNAi应用于动物卵母细胞2000年,Wianny等首次将RNAi技术应用于小鼠卵母细胞研究,即选取在卵泡中表达的c-mos基因作为靶基因,通过显微注射方式导入dsRNA,结果与对照组基因敲除小鼠实验结果完全相同,即c-mos基因表达被抑制,细胞减数分裂停滞在M期,说明RNAi可以用于哺乳动物细胞基因功能研究;向小鼠生发泡(G)期卵母细胞中显微注射三磷酸肌醇型受体基因(IP3R-)的dsRNA,该基因表达水平下调,实验组卵母细胞可发育至M期,但皮质颗粒胞吐作用显著降低,且钙离子瞬时释放量下降,表明卵母细胞成熟过程中,钙离子通道蛋白(IP3受体)与钙离子波动有一定关系;通过显微注射方法,将具有卵母细胞特定Zp3启动子的Msy2长链发夹dsRNA注入小鼠卵母细胞,以降低Msy2基因表达量,导致一些与卵母细胞成熟相关的蛋白质无法合成,说明Msy2基因在小鼠卵子发生过程中对母源mRNA稳定性具有调节作用;用RNAi方法抑制小鼠X连锁地中海智力低下综合征基因(ATRX)的表达,发现该基因对小鼠卵母细胞减数分裂的级数无影响,但在染色体排列和减数分裂M期纺锤体的形成中具有重要作用。1.2RNAi应用于哺乳动物胚胎发育 为了证实RNAi是否影响小鼠胚胎中的基因表达,Wianny等构建了转基因小鼠检测体系,该体系在延伸因子21a(ET21a)启动子调控下表达修饰型绿色荧光蛋白(MmGFP),将MmGFP的dsRNA注入单细胞受精卵,体外培养34d后,发现未注射dsRNA的胚胎中大量表达GFP,而注射组只有6.18%表现出微弱的荧光,说明dsRNA可以抑制GFP的表达;但在注入c-mos和E-cadherin的dsRNA单细胞受精卵中,GFP表达并不受影响,说明dsRNA具有抑制的特异性;若在小鼠受精卵中注入E-cadherin的dsRNA,则胚泡发育受阻;向单细胞胚胎注入mDicer的siRNA或长mDicer的dsRNA,以抑制小鼠胚胎中的RNAi,用于分析小鼠内源性逆转录酶L(MuERV-L)和IAP(顺反子内A粒子,intracisternalAparticle)2个自主性长端点重复序列在8-细胞期胚胎的表达情况,结果MuERV2L和IAP的表达量提高50%,说明RNAi抑制了重复寄生序列(repetitiveparasitic_sequences)在着床前胚胎中的表达,这种机制有助于保持基因组的完整性;在小鼠受精卵原核中注射Oct4的siRNA表达载体,发现该基因mRNA和蛋白质水平下降,胚胎发育停滞于囊胚期。由于易于收集和培养，因此鸡胚是进行动物体内实验的常用模型。Pekarik等首创用RNAi和卵内电穿孔相结合的方法进行活体基因功能研究,采用黄色荧光蛋白(YFP)作为指示蛋白,用电穿孔法将YFP和axonin21的dsRNA转入鸡胚,发现YFP和axonin21表达量明显降低;随后,Dai等构建了含有cAxin2和cParaxis两个目的基因siRNA的pEGFP2shRNA改良载体,用电转换法导入鸡胚神经管或体节中,发现cAxin2的表达被抑制,cParaxis的mRNA表达量和肌浆蛋白量减少。1.3RNAi应用于精子发生精子形成包括精原干细胞有丝分裂增殖、精母细胞减数分裂和精细胞形成等过程,是许多基因相互作用的结果。Shao等用电穿孔法向小鼠睾丸中导入外源报告基因,然后用同样的方法导入包含shRNA的DNA载体,发现报告基因的表达量在各个时期均有不同程度的降低,进一步用RNAi技术沉默精母细胞形成过程中编码DNA重组酶的内源性DMC1(DisruptionofMeioticControl),结果发现DMC1基因沉默小鼠精母细胞发育停滞、不育,该实验体系为在体内研究精子发生相关基因的功能提供了一条新的思路;用RNAi技术沉默葡萄球菌激酶(Staphylokinase,SAK),结果显示其与人类细胞中心体的复制有关,缺乏SAK基因的细胞表现为中心体复制受阻,大部分精细胞不能形成精子轴丝;小鼠支持细胞中威尔氏瘤基因(Wilmstumor,WT1)沉默后,其干细胞凋亡率增高,粘附能力丧失,受精率降低,说明WT1能够启动支持细胞干细胞信号传导,从而促进精子的形成;磷脂酶C-zeta(PLC2)基因是睾丸特异性基因,可能与雄性干细胞发育有关,如果精子中缺少PLC2,会造成男性不孕症,Williams和Schultz在前人研究基础上,进一步证实该基因会引起一连串卵子上钙离子的冲击而诱发卵子受精。2基因芯片技术基因芯片(gene-chip),又称DNA微阵列(DNAmicroarray),是指固着在载体上的高密度DNA微点阵(Ehricht等,2005)。基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法(southern、northern)是一致的,都是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交,通过随后的信号检测进行定性与定量分析,其最大的优点在于能在一微小的基片(硅片、玻片、塑料片等)表面集成大量的分子识别探针,在同一时间内平行分析大量基因,进行大信息量的筛选与检测分析。试验结果表明,利用基因芯片数一次10min至数小时的试验,其获取的基因表达信息相当于传统的northern杂交数月60多万次杂交的信息,这就非常适合于同时检测大量的基因表达变化。基因芯片的类型较多,根据储存的生物信息类型,基因芯片可分为寡核苷酸芯片和cDNA微阵列。依据探针合成的顺序分为:原位合成基因芯片和预先合成后上样的基因芯片,前者通过聚乙二醇或硅烷类化学试剂在不同位点合成不同的探针,后者比较简单,先制备好cDNA或寡核苷酸,然后在经特殊处理的玻片、硅片或膜上点样;按照基因芯片的用途可分为:基因表达芯片和DNA测序芯片,前者是对不同来源的样本进行差异基因表达分析,来确定该基因的功能,且可进一步研究基因与基因间相互作用关系,后者则是对大量基因进行序列分析。2.1基因芯片在动物繁殖中的开发和应用目前在猪或其他家畜品种中基因芯片的应用远没有在人类和小鼠中广泛,原因之一是家畜的基因组测序要远远落后于小鼠和人,因此DNA芯片技术最近才得到研究者的应用。到目前为止,DNA芯片在动物繁殖应用的报道仍然较少,Lee(2005)用不同发育天数的猪胚胎与自制的尼龙膜芯片杂交,发现了在猪胚胎早期发育过程中的差异表达基因,为研究早期胚胎发育或死亡的分子机理提供了依据。在卵巢癌发展过程中,基因TP53起到临界基因作用,Chen等(1997)分别使用传统的DNA序列分析法和一种TP53寡核苷酸微阵芯片对108例卵巢肿瘤进行分析,根据TP53突变共计识别77例卵巢癌,使用微阵列分析识别71例,寡核苷酸微集阵列显示出更高的精确度和灵敏度。Ledger等(2004)和Moser等(2005)建立了猪免疫或繁殖器官的cDNA芯片进行抗病功能基因组学的研究。应用cDNA芯片的一个缺点是要建立文库并对大量基因克隆进行PCR扩增,芯片上较长的cDNA的保守区域可能会与同家族的其他基因杂交造成假阳性。针对上述情况,美国Qiagen-Operon公司与美国猪基因组计划协调人MaxRothschild教授领导的猪基因芯片用户委员会合作,设计并合成了猪13297个70bp长的寡聚核苷酸片段,这些片段几乎均设计自每个基因的非保守区(即3非翻译区),这些片段在人的所有染色体上都可找到同源基因,是进行猪功能基因组学研究的有力工具。最近,第一代猪的23937个基因的Genechip也由美国Affymetrix公司推出,但其价格相当昂贵,在经费不是相当充足的实验室难以推广应用。上述2种猪基因组芯片技术的开发为猪繁殖性能的功能基因组学研究提供了新方法(Zh