冠心舒通对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用.doc

有冠心舒通胶囊对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用梁卓1 姚天明2 霍煜1 王健3 韩雅玲2(1. 第四军医大学西京医院心血管内科，西安 710032；2. 沈阳军区总医院心血管内科，沈阳 110016；3. 辽宁中医药大学心血管内科，沈阳 110016)通讯作者：韩雅玲，博士，沈阳军区总医院心血管内科，沈阳，110016，E-mail address: 【摘要】 目的 探讨冠心舒通胶囊对大鼠心肌缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用。方法 45只雄性SD大鼠随机分为假手术组(15只)、模型组(15只)和药物组(15只)，模型组和药物组大鼠通过心脏左前降支结扎与松开的方法制备缺血再灌注损伤(MIR)模型(心肌缺血30min，再灌注3h/24h)，假手术组的大鼠前降支只穿线不结扎。药物组大鼠在模型建立前5天开始每天给予冠心舒通胶囊，每次按1.5g/kg取药，溶于生理盐水，6ml/kg灌胃，每天两次，假手术组和模型组只给予同等剂量的生理盐水。每组10只大鼠在心肌缺血30min再灌注3h后，采血离心取上清用ELASA方法检测血清中肿瘤坏死因子 (TNF-)、白介素-1(IL-1)、白介素-6 (IL-6)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)水平，采血后处死大鼠，收集心脏标本，行免疫荧光染色、免疫组化检测、凋亡检测和核内核转录因子-B (NF-B)的western blot检测。每组剩余5只大鼠在心肌缺血30min再灌注24h后，检测梗死面积。结果 与假手术组比较，模型组大鼠血清中的TNF-、IL-1、IL-6、ICAM-1水平、凋亡指数(AI)、梗死面积大小明显升高均明显升高，NF-B被激活；与模型组相比，药物组大鼠的血清中的TNF-、IL-1、IL-6和ICAM-1水平、凋亡指数(AI)、梗死面积大小均明显降低，NF-B活性受到明显抑制(P均 0.05)。结论 冠心舒通胶囊可以保护大鼠心肌缺血再灌注损伤，其可以抑制NF-B激活，进而抑制缺血再灌注后炎症反应。【关键词】冠心舒通胶囊；心肌缺血再灌注；核转录因子-B；炎症；凋亡；心功能Effects of Guanxinshutong (GXST) on protection of myocardium ischaemia/reperfusion injury in ratsLiang Zhuo1, Yao Tian-ming2, Huo Yu1, Wang Jian3, Han Ya-ling2(1Department of Cardiology, XiJing Hospital, The Fourth Military Medical University, 710032, Xi-an, China; 2Department of Cardiology, Shenyang Northern Hospital, 110016, Shenyang, China; 3Department of Cardiology, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 110016, Shenyang, China)Corresponding author: Han Ya-ling, M.D. Department of Cardiology, Shenyang Northern Hospital, 110016, Shenyang, China. E-mail address: .Abstract Objective To assess the effects of Guanxinshutong capsule (GXST) on protection of myocardium ischaemia and reperfusion (MIR) injury in rats. Methods Forty five male Sprague Dawley rats were randomized to Sham-operated group (15 rats), Model group (15 rats) and Drug group (15 rats), I/R was induced by ligating the left anterior coronary artery(LAD) for 30 minutes followed by 2h/24h reperfusion in Model and Drug groups, while in Sham-operated group the LAD was only exposed without occlusion procedure. From 5 days before surgery, GXST (1.5g/kg, two times per day, for Drug group) or saline (for Model and Sham-operated groups) was administered via direct gastric gavage. At the end of 2h of reperfusion, blood samples were collected from carotid artery (10 rats each group) to determine the levels of tumor necrosis factor- (TNF-), interleukin-1 (IL-1), IL-6 and ICAM-1 through ELASA, then the animals were sacrificed and the hearts were harvested for immunofluorescence, immunohistochemistry, detection of cardiomyocyte apoptosis and western blot for determination of NF-B activity in nucleus. At the end of 24h of reperfusion, measurement of infarct size was performed. Result Compared with sham-operated rats, levels of TNF-, IL-1, IL-6, ICAM-1,apoptosis index (AI), infarct size were significantly increased, and NF-B was obviously activated in Model group (all P 0.05). In contrast, compared with rats in Model group, levels of TNF-, IL-1, IL-6, ICAM-1, apoptosis index (AI), infarct size were lower, and NF-B was inhibited obviously in Drug group (all P 0.05). Conclusion GXST capsule is effective in protecting myocardium I/R injury in rats. It can inhibit NF-B activation, thus prevents excessive inflammatory response to myocardial I/R injury in rats.key words Guanxinshutong capsule; Myocardial ischaemia/reperfusion; NF-B; Inflammation; Apoptosis免疫应答和炎症反应等在心肌缺血再灌注(MIR)损伤中发挥着至关重要的作用1，抑制各种促炎症性细胞因子可以减轻MIR损伤2,3。核转录因子-B(NF-B)在机体的免疫应答和炎症反应中具有重要作用4，心肌缺血再灌注过程中可以激活NF-B，启动前炎症性细胞因子、黏附分子等基因的大量转录表达，造成心肌损伤5，抑制NF-B活性可以缓解MIR损伤6。近年来，大量中医药基础研究表明，部分中医药在MIR损伤过程中的NF-B信号转导通路方面发挥重要作用，包括对NF-B的信号转导的调控作用、NF-B信号转导靶基因的调控作用、NF-B信号转导上游基因的调控作用、NF-B信号转导刺激因子的调控作用、NF-B信号转导促凋亡作用的调控7。但是目前中医药的研究集中在单味中药和有效成分的较多，复方应用研究很少，没有体现中医药多层次、多靶点的作用特点。冠心舒通胶囊由广枣 、丹参、丁香 、冰片、天竺黄等药材按一定比例组成，部分动物实验已经证实，预防性应用冠心舒通胶囊7天可以降低大鼠急性心肌梗死后90分钟观察期内的心电图J点抬高值，减小大鼠急性心肌梗死6小时后的梗死面积，降低其血清中乳酸脱氢酶、肌酸激酶、天门冬氨酸氨基转移酶的活性8。部分临床试验也验证了冠心舒通胶囊预防和治疗冠心病心绞痛的显著疗效9。本实验通过建立大鼠的MIR损伤模型，研究冠心舒通胶囊对大鼠MIR损伤的保护作用，及其对NF-B信号转导通路的调控作用，探讨其可能机制。材料与方法1 动物 健康SD雄性大鼠，体重220-240g，由沈阳军区总医院动物实验中心中心提供。 2 实验药物与主要实验试剂 冠心舒通胶囊，由广枣，丹参，丁香，冰片，天竺黄等五味药组成，陕西步长制药有限公司研制提供，批号：100519。肿瘤坏死因子 (TNF-)、白介素-1(IL-1)、白介素-6 (IL-6)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的ELASA试剂盒由南京生物建成提供。ICAM-1、NF-B p65抗体由Santa Cruz公司提供，Histone H1(P13)抗体由bioworld公司提供。Caspase-3抗体由IMGENEX公司提供。Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂盒由北京康为世纪公司提供。TUNEL试剂盒由ROCHE公司提供。伊文思蓝和TTC染液由北京索莱宝公司提供。免疫染色封闭液由碧云天生物技术研究所提供。增强型HRP-DAB底物显色试剂盒由Tiangen公司提供。3 主要实验仪器 ALC-V8动物呼吸机和ALCB10 MPA心功能分析系统(上海奥尔科特生物科技有限公司)。LEICA-CM1900冰冻切片机(德国)。LEICA-DM3000荧光显微镜(德国)。BIO-RAD 550酶标仪(美国)。RS 232C Eppendorf 测光仪(德国)。5417R Eppendorf离心机(德国)。4 动物分组及用药 取健康SD雄性大鼠45只，随机分为3组，分为：假手术组15只（Sham），给予生理盐水灌胃，每天两次，灌服5天；模型组15只(Sham)，建立MIR模型前，给予生理盐水灌胃，每天两次，灌服5天；冠心舒通胶囊组15只(Drug)，建立MIR模型前，给予冠心舒通胶囊灌胃，每次按1.5g/kg取药，溶于生理盐水，每次6ml/kg灌胃，每天两次，灌服5天。5 大鼠急性心肌梗死模型制备 大鼠禁食12h，自由饮水。术前记录大鼠导联心电图，剔除心电图异常者。30g/L戊巴比妥钠腹腔注射（1.5ml/kg），麻醉后固定。气管插管，接小动物呼吸机，呼吸频率为50-60次/分，持续记录心电图。沿左锁骨中线纵行剪开胸部皮肤约2cm，用止血钳纵行钳夹胸骨旁肌肉数次后剪开，在大鼠胸骨左侧2-3肋间隙靠胸骨处（约平腋下）钝性分离一小口，打开胸腔，剪开心包，完全暴露心脏，见左心耳和肺动脉圆锥后， 用5号针线在左心耳下缘垂直入针，于左心耳和肺动脉圆锥交界右侧出针后结扎左冠状动脉前降支，心肌梗死模型制备成功的判断标准为心电图出现ST段抬高的心肌梗死表现。每组大鼠在梗死30min后，松开结扎线，再灌注3h/24h。假手术组大鼠手术全过程与其它组相同，但对于左前降支只穿线不结扎。6 血清ELASA检测 每组随机取10只大鼠在缺血30min后再灌注3h，心脏采血，离心取上清(3000h/min，20min)，200l分装后-80冷藏待测。采用ELASA的方法检测各组大鼠血清中的TNF-、IL-1、IL-6、ICAM-1水平，严格按照试剂盒说明书进行。7 免疫荧光染色 以上每组10只大鼠在采血处死后，随机取5只立即摘除心脏，冰生理盐水冲洗，剔除血管脂肪等多余组织。4%多聚甲醛固定4h，30%蔗糖脱水（4过夜），取结扎线下1mm处至心尖部的心脏标本，OCT包埋，-21冷冻，LEICA-CM1900冰冻切片机进行切片，5 um厚/张。-21保存用于免疫荧光染色、免疫组化染色和凋亡细胞检测。冰冻切片免疫显色封闭液室温封闭1小时后加入一抗（1:100），湿盒内4孵育过夜，PBS清洗后加入二抗（1:300），室温孵育2小时PBS清洗后DAPI（1:300）染核，荧光显微镜下观察结果拍照。8 免疫组化染色 心脏标本的冰冻切片制作如上所述。冰冻切片消除内源性过氧化物酶后，免疫显色封闭液室温封闭10分钟，加入一抗（1:100），湿盒内4孵育过夜，PBS清洗后加入生物素标记二抗（1:300），室温孵育2小时，按照增强型HRP-DAB底物显色试剂盒说明书进行DAB显色拍照。9 心肌细胞凋亡的检测 心脏标本的冰冻切片制作如上所述。每一标本各取切片1张，采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)标记凋亡细胞核中DNA3-OH末端，通过原位荧光标记显示凋亡细胞。凋亡细胞计数分析：按TUNEL试剂盒说明书进行反应后，凋亡心肌细胞发绿色荧光，所有有核细胞经DAPI染核后发蓝色荧光。每张切片在荧光显微镜高倍视野下（400）,在缺血区随机选择4个视野，计数每个视野下的细胞总数和凋亡细胞数，计算凋亡指数(AI)（心肌细胞凋亡指数% =凋亡心肌细胞核数/总计心肌细胞核数 100%）。10 核蛋白的western blot 以上10只大鼠在采血处死后，5只大鼠的心脏标本如上所述用来制备冰冻切片，另外5只大鼠采血处死后立即摘除心脏，在冰上剪取左心室前壁并电子称称重，按照Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂盒说明书对核蛋白进行提取，30l分装后-20冷藏保存。测量蛋白浓度并配平稀释后，沸水煮5分钟，12000h/min离心3分钟，以8SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，半干电转移法转移至PVDF膜，室温下封闭2h后加入一抗(1:1000稀释)，4孵育过夜，加二抗 (1:1000稀释)反应2h，化学发光法显色，x射线底片曝光。Histone作为内参照。利用Quantity One软件测积分灰度值，以各组蛋白表达量与Histone表达量比值进行半定量分析。11 心肌梗死面积测定 检测完左心室功能的大鼠，打开胸腔再次原位结扎左冠状动脉，然后在左心室腔注入1.5%伊文氏蓝磷酸缓冲液（约2ml），将心脏蓝染后，取出心脏，在冰生理盐水中涮洗，并将心脏放入-20冰箱中冰冻数分钟使心脏稍变硬，垂直其长轴横行切片（约4片）,加入复温的1%TTC磷酸缓冲液(pH7.4)，37孵育20min，心肌梗死区为灰白色，周围缺血区为暗红色，正常区为蓝色。通过图像分析系统(Image Pro-plus, version 6.0； MediaCybernetics, Inc. Bethesda, MD) 计算梗死区面积/缺血区面积比值(IS/AAR)，作为心肌梗死面积的定量分析指标。12统计学方法各组数据用(s)表示，两组间比较用t检验。应用SPSS软件进行统计分析，取P0.05为差异有统计学意义。结果1 冠心舒通胶囊可以减少大鼠MIR损伤后的梗死面积实验大鼠缺血30min再灌注24h后，通过伊文思蓝/TTC双染的方法评估各组大鼠心肌梗死面积。Figure 1显示Sham组几乎没有发生梗死，Model组发生梗死明显。与Model组比较，灌服冠心舒通胶囊后，Drug组的IS/AAR比值明显降低(22.86.2% vs.50.47.0%，P 0.05)。Figure 1 缺血30min再灌注24h后，收集心脏，应用伊文思蓝/TTC双染的方法计算各组大鼠梗死区面积/缺血区面积比值(IS/AAR)。光学显微镜下拍照（10），蓝色区域代表非缺血的正常心肌组织，红色区域代表缺血危险区心肌组织，白色区域代表梗死区心肌组织。Sham组几乎没有梗死发生，Model组显示MIR损伤后心肌梗死发生明显，Drug组IS/AAR比值明显下降(#P0.05 vs. Model, n=5)。2 冠心舒通胶囊可以减少大鼠MIR损伤后心肌细胞核内NF-B表达量实验大鼠缺血30min再灌注2h后，通过western blot方法检测各组实验大鼠左心室前壁心肌组织中细胞核内NF-B含量，心肌缺血再灌注损伤后，细胞核内NF-B含量明显增高(0.1730.064 vs.1.5990.242，P 0.05)，而灌服冠心舒通胶囊后，可明显降低细胞核内NF-B含量(1.2740.186 vs.1.5990.242，P 0.05) ( Figure 2A)。免疫荧光染色同样发现，心肌细胞缺血再灌注损伤后，可明显激活NF-B从胞浆到胞核的转位情况，而灌服冠心舒通胶囊后，可以明显抑制NF-B的核转位情况(Figure 2B)。Figure 2 (A) 缺血30min再灌注2h后，收集心脏提取核蛋白，western blot方法检测各组大鼠左室前壁心肌组织胞核内NF-B含量。和Sham组相比，MIR损伤后可以明显增高Model组胞核内NF-B含量(#P0.05 vs. Sham, n=5)，而Drug组胞核内NF-B含量和Model组相比明显降低(*P0.05 vs. Model, n=5); (B) 缺血30min再灌注2h后，收集心脏进行冰冻切片，免疫荧光染色(400)，观察各组大鼠左室前壁心肌组织内NF-B的核转位情况。NF-B发绿色荧光，所有细胞核经DAPI染色后发蓝色荧光，相同部位两种荧光图像合并后，绿色荧光镶嵌在蓝色荧光内代表NF-B的核转位发生。和Model组相比，Drug组NF-B的核转位激活受到明显抑制。3 冠心舒通胶囊可以减少大鼠MIR损伤后TNF-、IL-1、IL-6、ICAM-1水平实验大鼠缺血30min再灌注2h后，通过ELASA的方法检测各组大鼠MIR损伤后血清中前炎症性细胞因子和黏附分子的浓度，发现和Sham组相比，MIR损伤可以明显增加血清中TNF-(30.245.43 vs. 78.2621.43 pg/ml )、IL-1(92.8039.37 vs. 243.6423.39 pg/ml)、IL-6(18.578.22 vs. 67.6423.24 pg/ml)、ICAM-1(0.7150.092 vs. 1.7200.487 ng/ml)的浓度(P 0.05)。和Model组相比，灌服冠心舒通胶囊后可明显降低血清中TNF-( 49.649.67 vs. 78.2621.43 pg/ml)、IL-1(178.1033.07 vs. 243.6423.39 pg/ml)、IL-6(39.1314.25 vs. 67.6423.24 pg/ml)、ICAM-1(1.0820.218 vs1.7200.487 ng/ml)的浓度(P 0.05)(Figure 3)。对心肌组织脉管系统进行ICAM-1的免疫荧光染色同样发现，MIR损伤后ICAM-1在心肌组织脉管系统中的表达明显增多，而灌服冠心舒通胶囊后可以明显抑制ICAM-1在心肌组织脉管系统中的表达(Figure 4)。Figure 3 缺血30min再灌注2h后，ELASA方法检测各组大鼠血清中TNF-、IL-1、IL-6、ICAM-1水平，MIR损伤后可以明显增高Model组血清中TNF-、IL-1、IL-6、ICAM-1水平(#P0.05 vs. Sham, n=10)，而Drug组血清中TNF-、IL-1、IL-6、ICAM-1水平和Model组相比明显降低(*P0.05 vs. Model, n=10)。Figure 4 缺血30min再灌注2h后，收集心脏进行冰冻切片，免疫荧光染色(400)，观察各组大鼠心肌组织脉管系统ICAM-1的表达情况。ICAM-1发绿色荧光，细胞核经DAPI染色后发蓝色荧光。MIR损伤后ICAM-1在心肌组织脉管系统中表达明显增多；和Model组相比，Drug组心肌组织脉管系统中ICAM-1的表达受到明显抑制。4 冠心舒通胶囊可以减少大鼠MIR损伤后心肌细胞凋亡指数实验大鼠缺血30min再灌注2h后，TUNEL染色的方法检测各组大鼠心肌组织缺血区凋亡情况，计算AI。荧光显微镜下(400)发现Sham组基本上没有凋亡的发生，而Model组凋亡发生明显。和Model组相比，灌服冠心舒通胶囊可以明显抑制MIR损伤后凋亡的发生(17.27.0% vs. 28.04.9%，P 0.05) (Figure 5)。各组大鼠心肌组织缺血区Caspase-3的免疫组化也发现同样的趋势(Figure 6)。Figure 5 缺血30min再灌注2h后，收集心脏进行冰冻切片，免疫荧光染色(400)，观察各组大鼠心肌组织凋亡情况。凋亡细胞核发绿色荧光，所有有核细胞DAPI染色后发蓝色荧光。MIR损伤后Drug组心肌组织凋亡和Model组相比受到明显抑制，凋亡指数明显下降(#P0.05 vs. Model, n=5)。Figure 6 缺血30min再灌注2h后，收集心脏进行冰冻切片，免疫组化染色(400)，观察各组大鼠心肌组织Caspase-3的表达情况。Caspase-3如箭头所示棕黄色颗粒，MIR损伤后Drug组Caspase-3的表达和Model组相比有明显下降趋势。讨论本实验发现冠心舒通胶囊可以保护大鼠MIR损伤，减小心肌梗死面积，可能通过抑制NF-B的核转位，减少前炎症性细胞因子TNF-、IL-1、IL-6和细胞黏附分子ICAM-1的表达，抑制缺血区心肌细胞凋亡有关。NF-B是心脏应激反应的快速表达基因，转录产生的细胞因子和黏附分子等，可以直接引起血管内皮细胞和心肌细胞的损伤10。抑制NF-B的核转位，是中医药保护MIR损伤的一个重要靶点。蒺藜总皂苷、参附注射液和三七总皂苷等均可通过抑制NF-B活化及其下游靶基因的表达而发挥对MIR损伤的保护作用11-13。本实验发现冠心舒通胶囊可以明显减少细胞核内NF-B的含量，抑制NF-B的核转位，从而降低其下游靶基因蛋白的表达。NF-B的下游靶基因表达蛋白包括前炎症性细胞因子TNF-、IL-1和IL-6，这些细胞因子在MIR损伤的炎症调控中发挥重要作用，可启动和诱导中性粒细胞内流入缺血区心肌组织，诱导心肌细胞ICAM-1的表达，增加内皮通透性，刺激中性粒细胞和细胞粘附分子与心肌细胞结合从而损伤心肌14-16。而另外一种靶基因表达蛋白即细胞黏附分子ICAM-1，在MIR损伤早期调控中性粒细胞与冠脉内皮细胞和心肌细胞的粘附及相互作用17。实验中发现冠心舒通胶囊可以降低MIR损伤后血清中TNF-、IL-1、IL-6和ICAM-1浓度以及心肌组织脉管系统中ICAM-1的表达，其对MIR损伤的保护可能通过抑制中性粒细胞激活及其与冠脉内皮细胞和心肌细胞粘附等而发挥作用。心肌细胞凋亡在MIR损伤过程中同样起着重要作用，研究显示在再灌注2-4h凋亡最明显18。NF-B活化可以启动心肌组织Bax等促凋亡基因表达19。人参、红花黄素可能通过抑制NF-B活化，下调Bax基因表达，增强Bcl-2基因表达，抑制MIR时所诱导的心肌细胞凋亡的发生20-21。另外，TNF-也可以诱导心肌细胞凋亡的发生22。本实验发现，冠心舒通胶囊可以明显抑制MIR损伤后凋亡的发生，降低Drug组AI值及Caspase-3蛋白的表达，可能与其抑制NF-B活化、降低TNF-水平有关，是否通过调节相关凋亡蛋白的表达而发挥作用，有待于进一步的机制研究。中医理论解释MIR损伤时，急性缺血期表现为瘀血阻滞，再灌注时，细胞内外水与电解质平衡骤然紊乱，气机、水液代谢失常，形成中医所谓之“痰饮”，瘀血、痰浊合而为患，从而痹阻脉络15,16。冠心舒通胶囊胶囊是在中医药及蒙医药理论相结合基础上研究开发而成，具有活血化瘀 、通经活络 、行气止痛的作用，符合中医理论的MIR损伤病因。本实验在中医理论的基础上，对冠心舒通胶囊在MIR损伤的保护方面进行了分子生物学等基础研究，进一步探讨并阐明了其发挥作用的具体机制。中医药治疗疾病往往通过多途径、多方位，作用于多靶点，冠心舒通胶囊在MIR损伤保护中的其它作用靶点及作用途径有待于我们进一步的研究探讨。参考文献1Yellon DM, Hausenloy DJ. 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