大豆异黄酮对去卵巢大鼠阴道上皮Bcl-2mRNA影响.doc

大豆异黄酮对去卵巢大鼠阴道上皮Bcl-2mRNA影响【摘要】目的探讨大豆异黄酮对去卵巢大鼠阴道上皮细胞凋亡及Bcl-2 mRNA表达的影响。方法Wistar大鼠50只，随机分为假手术组、模型组、雌二醇组、大豆异黄酮高剂量组及低剂量组。采用原位末端标记法及原位杂交方法检测阴道上皮细胞凋亡及Bcl-2 mRNA，并应用图像分析系统进行测定。结果雌二醇组、大豆异黄酮高、低剂量组均可使去卵巢大鼠阴道重量增加，分别为(0.1250.024)，(0.1230.020)，(0.1090.022) g,与模型组(0.0740.046) g比较,差异均有统计学意义(P0.01)；假手术组未见凋亡细胞，其余各组均可见凋亡细胞，大豆异黄酮高、低剂量组凋亡细胞数与雌二醇组比较,差异均有统计学意义(P0.05)；雌二醇组、大豆异黄酮高、低剂量组的Bcl-2 mRNA平均灰度值与模型组比较,差异均有统计学意义(P0.05)，但大豆异黄酮高、低剂量组的Bcl-2 mRNA平均灰度值与雌二醇组比较，差异均无统计学意义。结论大豆异黄酮可以抑制阴道上皮细胞的凋亡，通过上调Bcl-2 mRNA的表达是其作用途径之一。 【关键词】 去卵巢大鼠；大豆异黄酮；Bcl-2 mRNA；阴道上皮细胞Effect of soy isoflavone on Bcl2 mRNA expression in vagina of ovariectomy rats SUN Xiaofang,DUAN Fei.School of Medicine,Hebei University(Baoding 071000,China) Abstract： Objective To study the effect of soy isoflavon on cell apoptosis and Bcl2 mRNA expression in the vagina of ovariectomy rats.Methods Fifty adult female Wistar rats were divided into 5 groups:shamoperated group,model group,estradiol group,high soy isoflavone group and soy isoflavone group.TURNEL staining and in situ hybridization with image analysis system were applied to detect vaginal epithelial cell apoptosis and Bcl2mRNA.Results The number of apoptotic vaginal epithelial cells in rats of estradiol and high,lowdose soy isoflavone group significantly reduced(P0.01),and the Bcl2mRNA average gray value increased(P0.05).Compared with the estradiol group,the number of apoptic cells in high and low dose soy isoflavones was significantly higher(P0.05),while the Bcl2mRNA was not different between the estradiol group and the soy isoflavone groups.Conclusion Soy isoflavones may inhibit the apoptosis of vaginal epithelial cells through increased expression of Bcl2mRNA. Key words：ovariectomy rats;soy isoflavone;Bcl-2mRNA;vaginal epithelia cell 女性绝经以后，由于卵巢功能停止，激素代谢紊乱，易患绝经期综合征。目前，临床上多采用激素替代疗法进行治疗，但此疗法可出现不规则的阴道出血，增加患子宫内膜癌及乳腺癌的潜在危险，从而使其应用受到限制。大豆异黄酮结构与雌激素相似，为杂环酚类化合物，其在具有雌激素作用的同时，还具有抗雌激素作用，可以减少子宫内膜癌的发生机率。本研究通过比较观察大豆异黄酮和雌二醇对去卵巢大鼠阴道上皮细胞凋亡及凋亡调控基因Bcl-2 mRNA表达的影响，探讨大豆异黄酮的作用机制，为实际应用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 实验动物 健康清洁级Wistar雌性大鼠50只，月龄为34个月，体重为(23010) g(北京维通利华公司)，动物合格证号：SCXK京2005-2006。实验期间饲喂在二级动物室，温度为(251) 。 1. 2 主要试剂 雌二醇(北京四环制药厂，批号20060403)；大豆异黄酮(厦门海之王科技开发有限公司，批号20070202)，纯度为15；原位凋亡试剂盒，原位杂交Bcl-2 mRNA试剂盒(北京中山生物试剂公司，批号：20070502)。 1.3 方法 1.3.1 动物分组及处理 Wistar雌性大鼠50只，随机分为5组，每组10只。分别为假手术组、模型组、雌二醇组、大豆异黄酮高剂量组及低剂量组。除假手术组大鼠仅进行手术步骤，不摘除卵巢外，其余各组大鼠均将双侧卵巢摘除。手术后，各组大鼠正常饮食1周，从第2周开始每日灌胃给药，持续6周，其中假手术组和模型组生理盐水灌胃；雌二醇组给予雌二醇6 μg/100 g；大豆异黄酮高剂量组给予大豆异黄酮300 mg/100 g；大豆异黄酮低剂量组给予大豆异黄酮60 mg/100 g。造模6周后，用1.5戊巴比妥(2.5 ml/kg)将大鼠腹腔麻醉，剪开大鼠腹正中线，将阴道与周围脂肪组织完全剥离称重。 1.3.2 阴道上皮凋亡细胞检测 采用原位末端标记法(TUNEL)1。阴道上皮细胞蛋白酶消化后由甲醇配制的0.3 H2O2封闭内源性过氧化物酶活性，在脱氧核苷酸末端转移酶(TDT)与荧光素连接的核苷酸混合缓冲液内孵育，滴加二氨基联苯胺(DAB)显色。阴性对照是将制备好的样品加标记液孵育，用去掉TDT酶的标记体系处理标本。根据TUNEL法，细胞核内有棕黄色颗粒者判定为凋亡细胞。每张切片取4个高倍视野，计数阴道上皮凋亡细胞。 1.3.3 Bcl-2mRNA原位杂交检测2 阴道上皮细胞石蜡切片脱蜡至水；3H2O2室温处理10 min以灭活内源性过氧化物酶；3柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶37 消化5 min；滴加20 μl预杂交液置湿盒中，放入恒温箱37 2 h，滴加20 μl含探针的杂交液，恒温箱37 杂交过夜(12 h)。滴加封闭液37 30 min；滴加生物素化鼠抗地高辛，37 60 min；滴加链霉卵白素(SP)免疫组织化学反应(SABC)，37 20 min；滴加生物素化过氧化酶，37 20 min；滴加DAB，显色10 min。自来水冲洗10 min；苏木素复染1 S，充分水洗；乙醇脱水，二甲苯透明，封片。Bcl-2 mRNA以细胞质及细胞核内出现棕黄色着色者为阳性。使用医学图像分析仪(TN-8502)，镜下观察各组染色结果，测定细胞灰度值，用OS-9数据分析软件分析Bcl-2 mRNA的表达量。每组取5张切片，每张切片选5个视野。 1.4 统计分析 采用SPSS 10.0统计软件进行分析。 2 结 果 2.1 各组别大鼠阴道重量比较 雌二醇组、大豆异黄酮高、低剂量组均可使去卵巢大鼠阴道重量增加，分别为(0.1250.024)，(0.1230.020)，(0.1090.022)g，与模型组(0.0740.046) g比较，差异均有统计学意义(P0.01)。 2.2 各组别阴道上皮凋亡细胞数及Bcl-2mRNA灰度值比较(表1) 假手术组未见凋亡细胞，其余各组均可见凋亡细胞，其中模型组最多，与雌二醇组、大豆异黄酮高、低剂量组比表1 各组别凋亡细胞数及Bcl-2mRNA灰度值比较注：与模型组比较，a P0.05；与雌二醇组比较，b P0.05。 较，差异均有统计学意义(P0.05)；大豆异黄酮高、低剂量组凋亡细胞数与雌二醇组比较，差异均有统计学意义(P0.05)；雌二醇组、大豆异黄酮高、低剂量组的Bcl-2 mRNA平均灰度值与模型组比较，差异均有统计学意义(P0.05)；但大豆异黄酮高、低剂量组的Bcl-2 mRNA平均灰度值与雌二醇组比较，差异均无统计学意义。 3 讨 论 本次研究结果表明，去卵巢可以使大鼠阴道上皮细胞中Bcl-2 mRNA基因表达下降，阴道上皮细胞凋亡的发生与Bcl-2 mRNA基因表达相关。大豆异黄酮高、低剂量组和雌二醇组的Bcl-2 mRNA基因表达结果与模型组比较,差异有统计学意义(P0.05)，提示大豆异黄酮和雌二醇均能够上调Bcl-2 mRNA基因，从而抑制阴道上皮细胞凋亡。本次实验采用原位末端标记法检测凋亡细胞数的结果显示，雌二醇和大豆异黄酮高、低剂量组均可明显降低去卵巢大鼠阴道上皮凋亡细胞个数(P0.05)，并且大豆异黄酮高、低剂量组凋亡细胞数与雌二醇组比较差异有统计学意义(P0.05)。说明雌二醇和大豆异黄酮抑制阴道上皮细胞的凋亡存在相同的途径即上调Bc