卵母细胞成熟过程MPF的调控和MPF的作用底物.doc

卵母细胞成熟过程MPF的调控和MPF的作用底物【摘要】系统综述卵母细胞成熟过程中成熟促进因子的调控及其作用底物。研究表明，卵母细胞成熟过程中，成熟促进因子的活性受Cdc25、Myt1和Wee1蛋白以及泛素信号途径的调控，而成熟促进因子本身又可作用于下游的信号分子，如Aurora A蛋白、核纤层蛋白和组蛋白等，来发挥其在成熟过程中的中心调控作用。 【关键词】 卵母细胞；减数分裂 ；成熟促进因子Mechanism underlying regualtion and role of maturation promoting factor during oocyte maturationXIA Lei, ZHANG Ling, WU Kun.The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China; Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Harbin Medical University, Harbin 150081, China【Abstract】 This review covers the regulation of maturation promoting factor and its role during oocyte maturation. Upstream signal molecule such as Cdc25, Myt1 and Wee1 protein, as well as ubiquitindependent signaling system is required for regulation of MPF activity, while MPF plays a central role during maturaion process, regulating the activity of many downstreem factors, including Aurora A, lamine and histone protein and so on.【Key words】 Oocyte; Meiosis; Maturation promoting factor卵母细胞减数分裂从胎儿期开始，到出生前后停滞于第1次减数分裂前期(双线期)，青春期再恢复，最终停滞于第2次减数分裂中期(M期)，形成成熟卵母细胞。从减数分裂恢复到成熟卵母细胞的形成这个过程称为卵母细胞的成熟过程。近年的研究表明，多种信号途径参与调节卵母细胞成熟过程，其中成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)是调节卵母细胞成熟关键的信号分子，它介导着多种信号通路的生理功能可通过多种机制调节卵母细胞成熟，同时也受多种因子的调控。这样形成一套以MPF为中心的卵母细胞成熟调控网络。本文就MPF的调控因子和MPF的作用底物进行综述。1 卵母细胞成熟过程中MPF的调控 MPF是由调节亚基细胞周期蛋白cyclin B和催化亚基细胞周期蛋白依赖性激酶1(cyclindependent kinase1，CDK1，又可称为Cdc2)组成的复合体，其中，cdc2负责MPF的丝氨酸/苏氨酸(serine/threonine,Ser/Thr)蛋白激酶活性；cyclin B是MPF的调节单位，其表达因细胞周期而变化，以此调节MPF的活性。在多种生物体中，生发泡期(germinal vesicle,GV)卵母细胞中就形成PreMPF，其没有活性，Cdc2蛋白上Thr14、Tyr15和Thr161 3个位点被磷酸化。Thr161位上磷酸化是MPF活性所必需的，而Thr14和Tyr15是抑制性磷酸化位点，只有这两残基上去磷酸化，MPF才能被激活。在减数分裂过程中，MPF的活化还需要Cyclin B蛋白的聚积，当该蛋白达到的阈浓度并呈合适磷酸化状态时，在其它多种调节信号的作用下，最终触发PreMPF的活化1。下面着重阐述几种直接调节MPF活性的信号分子。1.1 Cdc25蛋白磷酸酶 Cdc25是1种重要的MPF生理激活剂，属于双向特异性蛋白磷酸酶，它直接使Cdc2蛋白上Thr14和Tyr15位去磷酸化来激活MPF。Cdc25磷酸酶包括3种亚型：Cdc25a、Cdc25b和Cdc25c，三者在细胞周期调控中都起着重要作用，其中Cdc25b和Cdc25c可调节减数分裂中MPF的活性。Cdc25蛋白上有多个磷酸化位点，其中Ser287位点属于抑制性位点，对调节Cdc25活性尤为重要。当该位点被磷酸化，Cdc25呈失活状态；磷酸化的Ser287位点可被1433蛋白识别，促进1433蛋白与Cdc25的结合，稳定Cdc25磷酸化和无活性状态。当Cdc25蛋白的激活性位点被磷酸化后，Cdc25被激活，同时这也促使Cdc25蛋白与1433蛋白的分离，使Ser287位点易于发生去磷酸化，这样进一步激活Cdc252。 卵母细胞成熟过程中有多种因子调节着Cdc25的活性。Polo样激酶1(polo like kinase 1,Plk1)可直接磷酸化激活Cdc25。在非洲蟾蜍卵母细胞提取液中，活化的Plk1可激活Cdc25，同时MPF也发生活化，Plx1免疫耗竭会阻止Cdc25的活化3。值得注意的是：在G2/M转化期，cyclin B蛋白合成、Myt1(负调节MPF活性)活性下降和Cdc25的活化共同来激活MPF，活化的MPF活性又正向调节Plk1和Cdc25，形成正反馈循环，放大MPF激活效应4。另外，cAMP/cAMP依赖性蛋白激酶A(cAMPdependent protein kinase A,PKA)、Ca(2+)/钙调素依赖性蛋白激酶II(calmodulindependent protein kinase,CaMKII)等均可通过Cdc25来调节MPF的活性。CaMKII和PKA都可直接磷酸化Cdc25蛋白上抑制性位点Ser287，并促进Cdc25与1433蛋白的结合，抑制Cdc25的活化，以此阻断了MPF的激活5，6。所以Cdc25是其他信号通路与MPF发生联系的重要环节。1.2 Wee 1蛋白激酶 Wee1属于Ser/Thr蛋白激酶，有Wee1A和Wee1B两种亚型。它可直接使Cdc2蛋白上的Tyr15位点发生磷酸化，抑制MPF的激活。在M期负调节因子Wee1促使MPF失活，促进细胞向后期相转化；正调节因子Cdc25可拮抗Wee1的作用，维持MPF的活性。2种因子共同作用的结果是MPF部分失去活性，这是卵母细胞M/M转化所必需的7，8。在非洲蟾蜍卵母细胞中，仅在M期检测到Wee1蛋白，而GV期和M期卵母细胞中均无Wee1蛋白存在，提示Wee1只在M/M转化过程中起作用。在M/M转化中，Wee1还可抑制DAN的合成，以此阻止细胞进入间期，形成减数分裂所特有的MM细胞周期进程8。 另外，有研究表明Wee1B在G2/M转化期也起着作用。过表达小鼠Wee1B会阻断孕酮诱导的非洲蟾蜍卵母细胞Cdc2激活和生发泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)的发生；降调节内源性Wee1B的翻译却可促进GV期小鼠卵母细胞恢复减数分裂，这与来自非洲蟾蜍的结果相违背。另外，Wee1也是联系cAMP/PKA信号系统与MPF之间的一个纽带，在体外实验，PKA催化亚基可直接磷酸化哺乳动物Wee1B蛋白的Ser15位点并使之活化。PKA抑制剂H89可阻断Wee1B的磷酸化与激活，最终Cdc2去磷酸化，MPF活化9。 Wee1可能还介导着其他信号途径的功能。在细胞周期进程DNA复制或DNA损伤修复时，DNA复制检查点(replication checkpoint)可通过多种途径阻止细胞进入中期相，防止损伤的DNA传到子代细胞。有研究表明在G2阻滞期非洲蟾蜍卵母细胞提取液中，一种甲基转移酶可与外源性Wee1蛋白结合，使Wee1蛋白泛素化，促进其降解。DNA复制检查点可通过调节Hsl7与其结合激酶Hsl1的结合，来干扰Hsl7与Wee1的结合，以此稳定Wee1活性，抑制MPF的激活和减数分裂的进行10。但是体内Hsl7对Wee1的作用还有待进一步研究，因为现在一般认为Wee1的作用只限于第1次减数分裂中，尤其是MM转化过程。1.3 Myt1蛋白激酶 Myt1是另1种调节MPF活性的蛋白激酶，它可使Cdc2的Thr14和Tyr15位点磷酸化，以此使之失活。在非洲蟾蜍GV期卵母细胞中只存在Myt1，而没有检测到Wee1；实验也证实GV期Myt1的确抑制了MPF的激活和减数分裂的启动，所以Myt1是维持G2阻滞状态的主要蛋白激酶8。卵母细胞恢复减数分裂时，Myt1活性开始下降，对MPF的抑制作用减弱，促进卵母细胞成熟过程的开始。在M期，改变内源性Myt1的表达模式不影响卵母细胞成熟过程，这可能是此时高度激活的MAPK/q90rsk抑制了Myt1的激活，Myt1不再起作用，由Wee1对MPF发挥抑制作用8。 Myt1本身也可被磷酸化激活，受到多种上游信号因子的调节，在卵母细胞成熟调节网络中，Myt1占有极其重要的地位，它被认为是联系MPF和Mos/MAPK/q90rsk级联途径的重要中介环节。Mos/MAPK/q90rsk级联途径是调节卵母细胞成熟的另1个重要的机制，在减数分裂过程中，该途径发挥的作用几乎与MPF同样重要，并通过多种途径作用于MPF。Mos/MAPK信号系统激活其底物核糖体S6激酶(p90rsk)，活化的p90rsk可与Myt1蛋白的C端结合，并磷酸化该C端结构，抑制Myt1的活性，促进MPF的活化11。1.4 后期促进因子(anaphasepromoting complex/cyclosome, APC/C)及相关蛋白对MPF活性的调节1.4.1 后期促进因子 随着减数分裂进行到中期相，MPF的活性达到峰值后，APC/C被激活。APC/C是1种E3泛素蛋白连接酶，可将泛素转移到靶蛋白上，促进靶蛋白水解。参与卵母细胞成熟过程调控的泛素连接酶中主要是APC/C，它负责将泛素连接到中期相周期蛋白上，使之被26S蛋白酶体水解。在中期相(M和M期)，当纺锤体组装完毕，染色体正常排列好后，APC/C被激活，它在2种激活剂(Cdc20和Cdh 1)的辅助下，识别Cyclin B蛋白上RXXL破坏盒(D box)，并将泛素连接到Cyclin B蛋白上，使其被26S蛋白酶体水解，MPF活性下降，促进MM转化或减数分裂的结束12。许多调控卵母细胞成熟的机制都通过调节APC/C的活性来实现的，如以Emi蛋白为主的细胞静息因子(cytostatic factor,CSF)和以Mad2为代表的纺锤体组装检查点(spindle assembly checkpoint,SAC)。1.4.2 CSF和Emi蛋白对MPF活性的调节 CSF指能抑制M期成熟的卵母细胞向后期转化的1种活性，有多种分子参与这种活性。Emi蛋白是卵母细胞成熟过程中具有CSF活性的主要分子，它包括Emi1和Emi2两个亚型，Emi1广泛存在于机体各组织中，而Emi2仅在精子和卵细胞中表达。在M期停滞的小鼠卵母细胞中，Emi1和Emi2可与Cdc20相互作用，阻碍Cdc20活化APC/C，从而抑制Cyclin B蛋白被泛素化而水解，维持MPF活性，使细胞处于M期停滞状态13，14。 另外，在卵母细胞发生G2/M转化和M/M转化时Emi1也是必需的。在用抗体中和Emi1之后，GV期非洲蟾蜍卵母细胞无法发生G2/M转化，细胞不能发生GVBD。若是在M/M转化过程时中和Emi1，细胞无法进入第2次减数分裂，而停滞在1个类似有丝分裂间期样的阶段，染色体去凝集，DNA发生复制。究其机制，发现Emi1也是通过Cdc20介导的APC/C途径来调节G2期和第1次减数分裂中Cyclin B水解的14。1.4.3 Mad2对MPF活性的调节 SAC是1种高度保守性的网络调节机制，在减数分裂过程中，SAC的生物学功能在于将后期相启动与动粒微管连接的建立密切衔接起来，避免染色体错误分离。Mad2是组成SAC的重要分子，Mad2通过抑制Cdc20活性来抑制了APC/C的活化，从而阻止Cyclin B的水解，维持MPF活性。在M/M转化过程中，适当的MPF活性下降是必需的，当着丝粒与微管形成稳定连接，染色体在赤道板上正确排列，成熟的中期相纺锤体组装完毕时，Mad2对Cdc20抑制被消除，MPF活性也随之下降，细胞发生M/M转化；相反，当中期相纺锤体存在缺陷或受损时，Mad2始终抑制着APC/C的活性，MPF活性维持在高水平，细胞无法进行MM转化15。2 MPF在卵母细胞成熟过程中的作用底物 早期的研究表明，MPF可以控制组蛋白磷酸化或乙酰化状态来调节染色质的凝集与去凝集；与微管蛋白和微管结合蛋白结合和作用，调节微管的组装；磷酸化核纤层蛋白，调节核纤层的组装；抑制染色体的分离等。最近的研究新发现一些MPF调节卵母细胞减数分裂的机制。2.1 MPF对蛋白激酶Aurora A调节 蛋白激酶Aurora 属于Ser/Thr蛋白激酶，动物体存在Aurora A、Aurora B、Aurora C 3个亚型，在卵母细胞中研究较多的是Aurora A。在减数分裂过程中，Aurora A主要定位于中心体和纺锤体极，负责中心体成熟与分裂，纺锤体的组装，其可能的作用底物是存在于微管负端的驱动蛋白相关性动力蛋白(kinesinrelated motor Eg5)。向卵母细胞中注射Aurora A抑制性抗体后，纺锤体形成出现明显异常，出现单极纺锤体，纺锤体过宽或过细，有的甚至细胞中无法形成纺锤体16。有研究表明，减数分裂过程中Aurora A的活性受MPF的控制。在孕酮作用下Aurora A蛋白开始在卵母细胞中聚积，此时的Aurora A蛋白合成不受MPF的调节，但随后Aurora A的活化需要MPF对其磷酸化。当用Cdc25，Cyclin B蛋白或岗田酸(蛋白磷酸酶抑制剂)激活MPF后，Aurora A发生磷酸化而激活；而人为抑制MPF活性后，Aurora A既没有发生磷酸化，也没有被激活，所以MPF对Aurora A的激活是充分且必要的。研究还表明MPF不能直接使Aurora A磷酸化，MPF激活Aurora A过程所涉及的具体机制有待进一步探讨17。2.2 MPF对核纤层蛋白的调节 核纤层蛋白是构成核纤层的重要组分，动物体内有A、B、C 3种核纤层蛋白，在细胞周期中，当核纤层蛋白呈磷酸化状态，核纤层解聚，核膜裂解。去磷酸化时，核纤层蛋白聚合，核膜重组。MPF可以通过磷酸化促进核纤层解聚和核膜破裂。Takano等18的研究表明MPF可调节核纤层与染色质的之间的相互联系。核膜在组装与去组装过程中会伴随着核内膜与染色质之间的连接与分离。核纤层蛋白B受体(lamin B receptor，LBR)可将核膜前体定位在染色质表面，促进核膜的形成。结果还表明在减数分裂G2/M转化过程，MPF可直接磷酸化LBR的Ser71位点，抑制LBR与染色质的连接，这样阻止核膜的组装，促进核膜破裂。2.3 MPF对组蛋白的调节 组蛋白是构成染色体的重要分子，它在维持染色体结构和基因表达中有重要作用。早期的研究证明MPF可以磷酸化组蛋白，以此调控染色体的凝集与去凝集状态。研究表明，在减数分裂过程中，组蛋白存在乙酰化与去乙酰化修饰，组蛋白的乙酰化是1种重要的翻译后修饰，它参与调控染色质的结构以及基因表达，组蛋白的去乙酰化则控制着正常减数分裂进程，它是染色质凝集所必需的19。MPF可控制着组蛋白的乙酰化。在小鼠卵母细胞成熟过程中，组蛋白乙酰化状态与MPF活性的波动模式是一致的，MPF活性可激活组蛋白脱乙酰基酶，抑制组蛋白乙酰化酶的活性，最终引起组蛋白H4上Lys12发生脱乙酰基20。但是MPF具体通过什么途径来调节组蛋白乙酰化酶和组蛋白脱乙酰基酶还有待进一步研究。 在卵母细胞成熟过程中，MPF受到多种调节因子调控，而MPF本身又可通过多种途径调节卵母细胞成熟进程。这样，以MPF为中心，多种信号因子/途径共同参与组成一个广泛的精细的卵母细胞成熟调控网络。【参考文献】 1Kuroda T, Naito K, Sugiura K, et al. Analysis of the roles of cyclin B1 and cyclin B2 in porcine oocyte maturation by inhibiting synthesis with antisense RNA injection J. Biol Reprod， 2004，70(1)：154159.2Margolis SS, Walsh S, Weiser DC, et al. PP1 control of M phase entry exerted through 1433regulated Cdc 25 dephosphorylation J. EMBO J， 2003，22(21):57345745.3Qian YW, Erikson E, Taieb FE, et al. The pololike kinase Plxl is required for activation of the phosphatase Cdc25C and cyclin BCdc2 in Xenopus oocytes J. Mol Biol Cell， 2001，12(6):17911799.4Karaiskou A, Jessus C, Brassac T, et al. Phosphatase 2A and polo kinase, two antagonistic regulators of cdc25 activation and MPF autoamplification J. J Cell Sci， 1999，112(Pt 21):37473756.5Hutchins JR, Dikovskaya D, Clarke PR. Regulation of Cdc2/cyclin B activation in Xenopus egg extracts via inhibitory phosphorylation of Cdc25C phosphatase by Ca(2+)/calmodulindependent protein corrected kinase II J. Mol Biol Cell， 2003，14(10):40034014.6Duckworth BC, Weaver JS, Ruderman JV. G2 arrest in Xenopus oocytes depends on phosphorylation of cdc25 by protein kinase A J. Proc Natl Acad Sci USA， 2002，99(26):1679416799.7Iwabuchi M, Ohsumi K, Yamamoto TM, Sawada W, Kishimoto T. Residual Cdc2 activity remaining at meiosis I exit is essential for meiotic MM transition in Xenopus oocyte extracts J. EMBO J， 2000，19(17):45134523.8Nakajo N, Yoshitome S, Iwashita J, et al. Absence of Wee1 ensures the meiotic cell cycle in Xenopus oocytes J. Genes Dev， 2000，14(3):328338.9Han SJ, Chen R, Paronetto MP, et al. Wee1B is an oocytespecific kinase involved in the control of meiotic arrest in the mouse J. Curr Biol， 2005，15(18):16701676.10Yamada A, Duffy B, Perry JA, et al. DNA replication checkpoint control of Wee1 stability by vertebrate Hsl7 J. J Cell Biol, 2004，167(5):841849.11Palmer A, Gavin AC, Nebreda AR. A link between MAP kinase and p34(cdc2)/cyclin B during oocyte maturation: p90(rsk) phosphorylates and inactivates the p34(cdc2) inhibitory kinase Myt1 J. EMBO J， 1998，17(17):50375047.12Chang HY, Levasseur M and Jones KT. Degradation of APCcdc20 and APCcdh1 substrates during the second meiotic division in mouse eggs J. J Cell Sci， 2004，117(Pt 26):62896296.13Shoji S, Yoshida N, Amanai M, et al. Mammalian Emi2 mediates cytostatic arrest and transduces the signal for meiotic exit via Cdc20 J. EMBO J， 2006，25(4):834845.14Tung JJ, Jackson PK. Emi1 class of proteins regulate entry into meiosis and the meiosis I to meiosis II transition in Xenopus oocytes J. Cell Cycle， 2005，4(3):478482.15Homer HA, McDougall A, Levasseur M, et al. Mad2 is required for inhibiting securin and cyclin B degradation following spindle depolyme