血清转氨酶(GPT、GOT)活性的测定.doc

血清转氨酶（GPT、GOT）活性的测定【原 理】酶的活性即酶的催化效能，在一定条件下酶活性的高低代表酶的含量的多少，故酶活性的测定也即相当于酶含量的测定。酶的活性通常都是在一定条件下（最适温度、最适的pH、必要的激动剂等），一定的时间内，测定该酶所催化的反应系统中底物的消耗量或产物生成量来确定的。血清谷丙转氨酶（SGPT）及血清谷草转氨酸（SGOT）分别以丙氨酸和-酮戊二酸；天冬氨酸和-酮戊二酸为底物，催化它们进行如下反应：在SGOT催化下所生成的草酰乙酸又可在脱羧酶和枸橼酸苯胺作用下脱羧，生成丙酮酸，而丙酮酸则可与2，4二硝基苯肼作用，生成丙酮酸2，4二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈棕色，在520nm比色时，-酮戊二酸二硝基苯腙之光吸收远丙酮酸二硝基苯腙为低。在反应后，-酮戊二酸减少而丙酮酸增加，故520nm处光密度增加之程度与反应体系中丙酮酸与-酮戊二酸之克分子比例成线性关系。一般临床上用以测定SGPT及SGOT活性的方法有改良的穆氏法、金氏法及赖氏法，这些方法都是基于上述原理而设计的，操作也基本相同，只是这些实验的某些条件、活性单位的规定和计算有所差异。改良的穆氏法（Mohun）规定血清在37（pH7.4）的条件下，与底物作用30分钟后，每生成2.5g丙酮酸为一个转氨酶活性单位。金氏法（King）则规定在同上条件下，与底物作用60分钟后，每生成1M丙酮酸为一个转氨酶活性单位。赖氏法（Reitman）本身并未对转氨酶活性单位提出规定，他是用卡门氏法 （Karman）来定单位的。卡门氏法是在紫外分光光度计中用1毫升血清，反应溶液总量为3毫升，在340nm波长下，用内径为1.0cm的比色皿，25 1分钟内所产生的丙酮酸，在乳酸脱氢酶作用下，使NADH变成NAD+，而引起光密度下降0.001为1个转氨酶活性单位。而赖氏法则是用卡门氏法所测出的单位数相当于赖氏法所产生的丙酮酸量的相关系数，套用卡门氏单位而来。由此可见，测定同一份血清的转氨酶活性，用不同方法测算，其值不一样。因而它们的正常值范围也可有显著差异。赖氏法：SGPT与SGOT的正常值均在40单位以下。金氏法：SGPT9135.8单位；SGOT8323.8单位改良穆氏法：SGPT2-40单位：SGOT4-50单位以上均以每100ml血清计目前国内多采用赖氏法。本实验即采用此法。【操 作】1、标准曲线绘制：取试管6支按下表操作。试 管 号对 照12345丙酮酸标准液（1毫升2微克分子）00.050.100.150.200.25SGPT或SGOT底物0.500.450.400.350.300.250.1M磷酸盐缓冲液PH7.40.10.10.10.10.10.1相当于谷丙转氨酶单位0285797150200相当于谷草转氨酶单位02461114190置37水浴30分钟，各管加2，4二硝基苯肼液0.5毫升，混匀，再在37水浴中放置20分钟，各管加0.4mol/L氢氧化钠溶液5毫升，混匀，10分钟后，从水浴箱中取出，以蒸馏水调“零”点，用520nm波长比色，读取各管之光密度，各管之光密度均减去对照管之光密度，然后以光密度为纵坐标，各管相应的转氨酶单位为横坐标。绘制成标准曲线。为了方便，可列出各光度相当于转氨酶单位表。2、酶活性测定：取试管两支，注明测定管及对照管。试剂（毫升）测 定对 照血 清0.10.1SGPT或SGOT底物0.5置37水浴30分钟（SGOT为37，60分钟后再加枸橼酸苯胺1滴）2.4二硝基苯肼0.50.5置37水浴20分钟SGPT或SGOT底物0.50.4N NaOH5.05.010分钟后，用520nm波长比色，以蒸馏水调节零点，读取光密度，用测定管光密度减去对照管光密度，由标准曲线查知转氨酶活力单位。【临床意义】谷丙转氨酶广泛在于机体的各种组织中，但以肝脏含量最为丰富。正常人血清中此酶活性甚低。由本实验方法测定SGPT正常值应在40单位以下。当肝脏有病变，特别是急性肝炎及中毒性肝细胞坏死时，血清中谷丙转氨酶活性显著增高。在肝癌、肝癌化及胆道疾病患时，此酶活性也可中度或轻度的增高。另外，其它脏器或组织的疾病，如心肌梗塞时，也可见血清谷丙转氨酶活性的上升。谷草转氨酶（正常在50单位以下）在机体以心肌含量最为丰富，其它组织如肝脏、肌肉、肾、肺亦含有此酶。急性心肌梗塞、急性肺炎及大手术后此酶活性明显增高；另外在肝、肾、心、肺、胸膜等脏器发生炎性病变时都可见此酶活性中度或轻度的增高。【附 注】1、不同血清对照管光密度基本相同，因此同一批标本只做23个血清对照管求其平均值即可，亦可作空白管来代替对照管。但脂血，溶血，黄疸血应单独做对照管。2、SGPT或SGOT超过200单位时，应将血清稀释后再进行鉴定，结果乘以稀释倍数。3、酶的活力测定与温度、时间影响很大，因此反应严重控制温度和注意掌握时间。4、血清标本不应溶血，且最好在采血之当日进行测定，如不能当日操作者，可储于冰箱4中12天。5、DL型丙氨酸，如改用L型丙氨酸，可减半量（因转氨酶只作用于L型丙氨酸）。6、光密度与丙酮酸的标准线成抛物线，是因为除丙酮酸与2.4二硝基苯肼在碱性溶液中能成腙外，酮戊二酸亦能与2.4二硝基苯肼产生苯腙。这是本实验方法的缺点。【试 剂】1、0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）13.97g及磷酸二氢钾（KH2PO4）2.69g溶解于1000ml蒸馏水中。2、SGPT底物：称DL-丙氨酸1.79g，-酮戊二酸29.2mg置于烧瓶内，加0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）约80ml煮沸溶解后，加1mol/LNaOH校正PH至7.4（约加0.1ml），再以缓冲液加到100ml。可分装成安瓿煮沸半小时，此安瓿可保存一年，（亦可加少量氯仿在冰箱中保存数周）。3、SGOT底物：称天门冬氨酸2.66g，-酮戊二酸29.2mg于烧杯中，加0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）约50ml煮沸溶解后，加1mol/LNaOH校正PH至7.4（约加20.5ml），再以缓冲液加到100ml。可分装成安瓿煮沸半小时，此安瓿可保存一年（亦可加少量氯仿在冰箱中保存数周）。4、枸橼酸苯胺溶液：取枸椽酸50g溶于50ml蒸馏水中备用，用前取枸椽酸溶液与等量体积苯胺混合即成。5、2.4二硝基苯肼溶液：称取2.4二硝