蔗糖合成酶的测定方法.doc

蔗糖合成酶的测定方法一、仪器设备冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计二、试剂HEPES-NaOH（50mmol/L，pH7.5）缓冲液，包括50mmol/L MgCI2；2mmol/LEDTA；0.2%(W/V)BSA；2%PVP；0.1%间苯二酚：称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖三、操作方法1、粗酶液制备称取0.5g样品（植物叶片去掉主叶脉），洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH缓冲液，冰浴研磨，10000g离心10min。2、酶活性测定依次加入 50L粗酶液，50LHepes-NaOH缓冲液pH7.5，20L 50 mmol/LMgCI2，20L 100mmol/L UDPG，20L 100mmol/L6-磷酸果糖（20L 100mmol/L果糖），30中反应30min后，加入200L 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1% 间苯二酚，摇匀后置于80水浴保温10min，冷却后置于480nm处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。同时取50L粗酶液，加入200L 2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。3、蔗糖标线制作：取0、40、80、120、160、200g/ml的蔗糖溶液50L，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。4、计算样品中酶活性（gg1h1）= 式中 C反应液催化产生的蔗糖总量（g）； V1提取酶液时加入的缓冲液体积（ml）； V2酶反应时加入的粗酶液体积（ml）淀粉酶活性的测定1方法1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液：0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液：用0.1mol/L-1的柠檬酸缓冲液(pH 5.6)配制；标准麦芽糖溶液(1mg/mL-1);3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):称取6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000 mL容量瓶中，加入325 mL 2molL-1 NaOH溶液，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000 mL。淀粉和麦芽糖为Sigma产品，其余试剂为国产分析纯试剂。1.2测定方法1.2.1酶液的提取 将每一个重复的3个果实去皮后切碎混匀，称取其果肉1g，置于预冷的研钵中，加2mL预冷的0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH5.6)和少量石英砂研磨，将匀浆移入7mL的离心管中，再分别用1mL的0.1mol/L-1柠檬酸缓冲(pH 5.6)冲洗2次,于4下以15000g离心15min，上清液转移入另一个5mL离心管中，作为酶提取液备用。1.2.2酶活性的测定取洁净的试管18支，作标记，每一个样品设1个对照。总反应体积为0.5mL，测定管含0.2mL的酶提取液和0.3mL的1%淀粉溶液；对照管含0.2 mL的酶提取液和0.3mL的0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6,不含底物淀粉)将试管放入恒温40的水浴锅中，保温30min后取出，立即加入1.5mL的DNS试剂终止反应再将试管置于沸水浴中10min，取出后冰浴冷却。取反应液稀释10倍，测定波长520nm处的吸光值，同上做麦芽糖标准曲线，从标准曲线上查出麦芽糖的含量，计算淀粉酶的总活性。周蓓云.-和-淀粉酶活性的测定.见：中国科学院上海植物生理研究所，上海市植物生理学会编.现代植物生理学实验指南.北京：科学出版社，1999.123124酸性转化酶活性的测定1.酶的制备和活性测定酶的制备参照Miron&schaffer(199l)以及王永章等(2。02)的方法，稍做修改。提取缓冲液为:150mmol/lTris一Hcl(pH8.0)，10mmol/lMgC12，10mmol/l抗坏血酸，2mmol/LEDTA一Na，lmmol/LBenzadine(苯甲脒)，0.1mmol/LPMSF和0.2%(v/v)一疏基乙醇，视发育阶段不同加入3%(w/，)PvPP。称取一定量的果肉，加入2-3倍体积冷的提取缓冲液，于高速匀浆器中快速破碎组织至匀浆，16000*g离心20min，上清液对稀释10倍的提取缓冲液(不含PvPP)透析20h，其间更换透析液3次。经透析的上清液用于可溶性酸性转化酶活性和数量的测定。离心得到的沉淀物用一定体积的提取缓冲液(不含PVPP)洗涤3遍，离心去上清液，沉淀用23倍体积的含0.5mol/LNaCI的提取缓冲液充分悬浮后，低温(4)下振荡浸提24h，16000*g离心20min，上清液透析后用于细胞壁酸性转化酶活性和数量的测定。透析方法同上。可溶性酸性转化酶和细胞壁转化酶活性的测定参照Miron&Schaffer(1991)的方法，测定反应液为0.1mol/L乙酸一乙酸钠缓冲液(pH4.8)，0.1mol/L蔗糖。用3，5一二硝基水杨酸测定其生成还原糖的量。蔗糖合成酶的测定方法蔗糖是重要的光合产物，为植物体内运输的主要物质，又是碳水化合物的暂贮形式之一。蔗糖合成酶（SS）、（SPS）是植物体内催化其合成的两种酶。这两种酶在生物体内的功能有所不同。蔗糖合成酶（SS）以游离果糖为受体，蔗糖磷酸合成酶（SPS）以果糖-6-磷酸为受体。后者形成的蔗糖磷酸，在蔗糖磷酸合成酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是蔗糖分解或形成核苷酸葡萄糖的系统。UDPG是合成蔗糖的葡萄糖供体，故催化UDPG合成的UDPG焦磷酸化酶活力的高低与蔗糖合成的速率有十分密切的关系。蔗糖的合成（二条途径）： 1、蔗糖合成酶 （非光合组织）UDPG+果糖 蔗糖+UDP2、磷酸蔗糖合成酶（光合组织）UDPG+F-6-P 磷酸蔗糖+UDP 磷酸蔗糖+H2O 蔗糖+Pi一、仪器设备冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计二、试剂HEPES-NaOH（50mmol/L，pH7.5）缓冲液，包括50mmol/L MgCI2；2mmol/LEDTA；0.2%(W/V)BSA；2%PVP；0.1%间苯二酚：称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖三、操作方法1、粗酶液制备称取0.5g样品（植物叶片去掉主叶脉），洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH缓冲液，冰浴研磨，10000g离心10min。2、酶活性测定依次加入 50L粗酶液，50LHepes-NaOH缓冲液pH7.5，20L 50 mmol/LMgCI2，20L 100mmol/L UDPG，20L 100mmol/L6-磷酸果糖（20L 100mmol/L果糖），30中反应30min后，加入200L 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1% 间苯二酚，摇匀后置于80水浴保温10min，冷却后置于480nm处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。同时取50L粗酶液，加入200L 2mol/L NaOH，以下同上操作，