大曲检验方法(洋河酒厂).doc

江苏苏酒集团股份有限公司 QJ/SJ05.012011QJ江苏苏酒集团股份有限公司企业标准 QJ/SJ05012011 曲质检验方法2011XXXX批准 2011XXXX实施 江苏苏酒集团股份有限公司 发布曲质检验方法1 主题内容与应用范围本标准规定了取样方法、曲质的感官检验和理化指标的检验方法。本标准适用于本企业的曲质检验。2 取样方法2.1 成熟曲以排为批量，贮存曲以库为批量，制曲部门应保证产品质量，质量部必须按本标准逐项检验，不合格产品不得投入使用。2.2 生产环保部在使用曲时，如对曲质有疑问，可以申请质量部对曲抽样复检，如不符合本标准，可以拒绝投入生产。2.3 抽取样品时，在每房的四角及中间的上、中、下，抽取100块，在100块中抽取10块，每库随机抽取若干块，进行感观检验和理化检验。2.4 粉碎方法：将所取的样品曲，用粉碎机粉碎。筛孔1mm。2.5 四分法（通常样品需要量500g）2.5.1混匀：将粉碎后的全部样品倒在光滑平坦的玻璃板上，用长直尺将样品摊成正方形，然后从样品左右两边铲起样品约10cm高，对准中心同时倒落，再换一个方向同样操作（中心点不动），如此反复45次。2.5.2缩分：将混合均匀的样品摊成等厚的正方形，用长直尺在样品上划二条对角线，分成四个三角形，去掉二个对顶三角形的样品，余下的样品按上述方法反复分取，直到接近所需试样质量时为止。2.5.3贮存：缩分后的样品，保存于磨口瓶中。样品在分析前，应使其达到室温后再开启，以免在大气中吸收水分。3 曲质的检验3.1 感官检验检查曲块表面、断面及香味(见QJ/XYJ04.14）。3.2 水份测定3.2.1仪器3.2.1.1表面皿3.2.1.2天平3.2.1.3干燥器3.2.1.4干燥箱3.2.2 测定方法3.2.2.1取表面皿洗净，烘干，放在干燥器中，待冷却至室温，称重。3.2.2.2抽样取曲。3.2.2.3把试样放在已恒重的表面皿中，称重W1（准确到0.001g）。3.2.2.4将干燥箱温度调至130，温度恒定后放入试样，烘烤45min。3.2.2.5取出，放置于干燥器中冷却至室温，称重W（准确到0.001g）。3.2.3计算 水份(%)(W-W0)100/(W1-W0)式中：W0表面皿重，g。 W1烘前试样与表面皿重，g。 W烘后试样与表面皿重，g。3.3 酸度的检验酸度定义：10g曲消耗0.1mol/L的氢氧化钠溶液的mL数，单位：mmol/10g曲。3.3.1试剂3.3.1.1 1%酚酞指示剂：配制方法按QJ/XYJ0504标准中9.3条款执行。3.3.1.2 0.1mol/L的氢氧化钠溶液配制及标定 a.将氢氧化钠配成饱和溶液，注于塑料桶中，密闭放置至溶液清亮。使用前以塑料管虹吸上层清液。 b.量取5mL氢氧化钠饱和溶液，注于1000mL不含二氧化碳的水中，摇匀。c.称取0.6g于105110烘至恒重的邻苯二甲酸氢钾，准确称至0.0002g，溶于50mL不含二氧化碳的水中，加2滴1%酚酞试液，用0.1N氢氧化钠溶液滴定至溶液所呈粉红色与标准色相同，同时作空白试验。 注：标准色配制。量取80mLpH8.5的缓冲液，加2滴1%的酚酞指示液摇匀。d.计算 CM(V1-V2)0.2042式中： C氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，mol/L M邻苯二甲酸氢钾之重量，g。 V1氢氧化钠溶液之用量；mL。 V2空白试验氢氧化钠溶液用量mL。 0.2042与1.00mL氢氧化钠标准溶液(1.000mol/L)相当的以克表示的邻苯二甲酸氢钾的质量。3.3.2 试样的处理3.3.2.1 称取5.0g曲（以绝干曲计），置入250mL烧杯中。3.3.2.2 加100mL水，摇匀，于室温下浸泡30min，经常搅拌。3.3.2.3 用滤纸过滤，滤液备用。3.3.3 检测3.3.3.1 吸取滤液10mL，置入150mL三角瓶中。3.3.3.2 加约20mL水、2滴1%酚酞指示剂，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液滴定至微红色。3.3.4 计算酸度CV（ 100/10） （10/5） 式中：C氢氧化钠溶液的摩尔浓度，mol/L。 V消耗氢氧化钠溶液体积，mL。 100/10100mL浸出液吸取10mL浸出液。 10/55g曲换算成10g曲。3.4 曲糖化酶活力（糖化力）检测3.4.1 试剂3.4.1.1 斐林氏溶液甲液：称取15g硫酸铜（CuSO45H2O）、0.05g次甲基蓝，溶解于水，稀释至1L。乙液：称取50g酒石酸甲钠，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，溶解于水，称释至1L。3.4.1.2 0.1%标准葡萄糖溶液称取预先在100105烘干的无水葡萄糖1.0g（用减量法快速称量，精确到0.0002g），溶解于水，加5mL浓盐酸，用水定溶至1L。3.4.1.3 2%可溶性淀粉溶液用分析天平准确称取干燥除去水分的淀粉2g （精确到0.001g），于50mL烧杯中用少量水调匀后，倒入盛有70mL沸水的150mL烧杯中，并用20mL水分次洗净50mL小烧杯，洗液合并其中，用微火煮沸到透明，冷却后用水定容至100mL，当天配制应用。3.4.1.4 醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH4.6） a、2mol/L醋酸 118mL冰醋酸用水稀释至1L。 b、2mol/L醋酸钠 称取醋酸钠（CH3COONa 3H2O）272g溶于水，稀释至1L。 c、将a，b两溶液等体积混合，即为pH4.6的缓冲液。3.4.1.5 1mol/L氢氧化钠溶液称取40g氢氧化钠，溶于水，稀释至1L。3.4.2 5%曲子浸出液制备称取相当于5.0g绝干曲的曲粉，放在250mL烧杯中，加水（90-5水份%）mL，缓冲液10mL，在30水浴中浸出1h，每隔15min搅拌一次。然后用干滤纸过滤，弃去最初5mL，接收50mL澄清滤液备用。3.4.3 糖化力测试液制备3.4.3.1 曲子浸出液的糖化试液准确吸取2%可溶性淀粉50mL于100mL容量瓶中，在35水浴中保温20min后，准确加入浸出液 10mL，摇匀并开始计时，在35水浴中保温1h。立即加入3mL1mol/L的氢氧化钠，振荡，以停止反应，再冷却至室温。用蒸馏水定容至刻度，此时溶液应呈碱性。3.4.3.2 空白试验液准确吸取2%可溶性淀粉50mL于100mL容量瓶中，先加入1mol/L氢氧化钠3mL，混合均匀后再加酶浸出液10mL，用蒸馏水定容、摇匀。3.4.4 糖分测定3.4.4.1 糖化液测定 准确吸取5mL糖化液于盛有斐林氏甲、乙液各5mL的150mL三角瓶中，加入适量0.1%标准葡萄糖 溶液，摇匀，在电炉上加热至沸后，立即用标准葡萄糖滴定至蓝色消失。此滴定应在1min内完成，滴定消耗葡萄糖体积V。3.4.4.2 空白液测定 以5mL空白液代替糖化试液，其它操作同上，消耗体积V0。3.4.5 计算 糖化酶活力= 1000 上面公式错误，改为（糖化酶活力）= 式中：V05mL空白液消耗0.1%标准葡萄糖液的体积（mL） V 5mL糖化液消耗0.1%标准葡萄糖液的体积（mL） p 标准葡萄糖溶淮浓度（g/mL） 510/100 5g干曲浸出后在100mL中取10mL进行糖化试验 5/100 在100mL糖化液中取5mL定糖 1000 换算成mg糖化酶活力1g干曲在35度pH4.6条件下反应1h，将可溶性淀粉分解为葡萄糖的mg数（u/g） 3.5 大曲发酵力的检测3.5.1 仪器3.5.1.1 发酵瓶3.5.1.2 蒸气灭菌锅3.5.1.3 工业天平3.5.2 试剂和溶液3.5.2.1 硫酸溶液 5mol/L（1/2H2SO4）。取14mL浓硫酸，边搅拌边缓慢加入50mL水中，用水稀释至100mL，不必标定。3.5.2.2 0.1mol/L（1/2I2）。不用标定。3.5.3 曲糖化液的制作3.5.3.1 制作糖液取生曲面（或大米）500g ，加水2500mL（原料：水=1：56），混匀，蒸煮至淀粉充分糊化，冷却至60，加糖化酶糖化，加入糖化酶5万单位量为：原料：糖化酶=500：210，在60糖化34h，碘液测定糖液是否糖化完全。具体做法是：取一滴碘液于白瓷板中，滴加一滴糖化液，如碘液不变色，即此糖化液已糖化完全。3.5.3.2 糖液灭菌 糖化好的糖液用四层纱布过滤，所滤清液在室温下调糖度至13。BX，分装灭菌。3.5.4 试验3.5.4.1 量取13。BX浓度的曲糖化液150mL，加入到250mL的发酵瓶中，塞上棉花塞，包好油纸，记下液面高度，用油纸包好发酵栓，二者同时放入蒸气灭菌锅中在0.1MPa下，灭菌30min。3.5.4.2 冷却至25左右，在无菌条件下，接入粉碎大曲粉1.00g在发酵栓中，量入5mol/LH2SO4(1/2H2SO4)硫酸10mL。3.5.2.3 用石腊封发酵瓶塞，用抹布擦干瓶外塞壁，置瓶于千分之一感量的工业天平上称量，记下读数。3.5.4.4 将发酵瓶置于25保温箱中，发酵48h。3.5.4.5 取出发酵瓶，轻轻摇动发酵瓶使二氧化碳尽量逸出，称重，读出读数。3.5.5计算 发酵力（以CO2的质量分数计g/10g）= 式中：W1发酵前发酵瓶重，g。 W2发酵后发酵瓶重，g。 W接入的大曲粉量，g。3.6液化型淀粉酶活力(液化力)的测定方法3.6.1原理液化型淀粉酶能将淀粉水解成糊精，以及少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝色特异反应逐渐消失，以该颜色消失的速度计算酶活力。3.6.2试剂3.6.2.1 原碘液称取碘11g，碘化钾22g，先用少量蒸馏水使碘完全水解后定容至500mL，贮于棕色瓶内。3.6.2.2 稀碘液取原碘液2mL，加入KI20g，用蒸馏水溶解定容至500mL，贮于棕色瓶内。3.6.2.3 2%可溶性淀粉精确称取可溶性淀粉（以绝干计）2.000g，然后用少量的蒸馏水调匀，徐徐地倾于煮沸的蒸馏水中，加热煮沸至透明为止，冷却定容至100mL。此溶液需当天配制。3.6.2.4 0.2M醋酸醋酸钠缓冲溶液（pH4.6）醋酸溶液：吸取冰醋酸11.8mL，加水定容至1000mL醋酸钠溶液：称取醋酸钠27.2g，加水定容至1000mL将醋酸溶液及醋酸钠溶液等体积混合即为pH4.6的缓冲溶液。3.6.3 检测步骤3.6.3.1 待测酶液的制备：称取5.0g绝干重的粉碎试样，加水90mL，加醋酸醋酸钠缓冲溶液10mL，在30浸泡1h（每隔15分钟搅拌一次），用滤纸或脱脂棉过滤取滤液备用。3.6.3.2 测定：取20mL（改为5ml）2%可溶性淀粉和5mL(改为1.25ml)pH4.6的醋酸醋酸钠缓冲溶液，放于20*200mm大试管中，在60恒温水浴中预热45分钟，然后加入预先稀释好的酶液10mL立即记录时间，充分摇匀。定时用滴管取出反应液约0.5mL滴于预先充满比色稀碘液（约1.5mL）的磁板空穴内，当穴内颜色反应由紫色逐渐变红棕色，与标准终点色相同时，即为反应终点，并准确记录时间t。3.6.4计算1g曲粉在60pH6.0的条件下，用一小时液化可溶性淀粉的克数表示。（g可溶性淀粉/g.h ）酶活力单位(202%n)10t60式中：6060min 20可溶性淀粉的毫升数n-稀释倍数t-测定记录时间（min） 2%-淀粉浓度10测定时的用酶量3.7 酯分解力测定3.7.1试剂和溶液3.7.1.1 pH4.6醋酸-醋酸钠缓冲液 2mol/L醋酸 118mL冰醋酸用水稀释至1L。 2mol/L醋酸钠 称取醋醋钠（CH3COOHNa3H2O）272g溶于水，稀释至1L。将、两溶液等体积混合，即为pH4.6的缓冲液。3.7.1.2 100mg/100mL己酸乙酯的20（体积分数）乙醇溶液。3.7.2 测定方法3.7.2.1酯解 吸取100mL己酸乙酯溶液于500mL三角瓶中，加入相当于5g干曲的曲粉和10mL pH4.6缓冲液。加盖，在3032保温反应100h （改为72h），加水40mL，蒸出100mL.酯含量的测定同酯化力测定方法。（把黄色部分去掉）同时做空白试验，在100mL己酸乙酯中加入同量曲粉和缓冲液后立即加水40mL。蒸出100mL测酯含量。3.7.2.2测酯 试样蒸出液和空白蒸出液各吸取50mL，分别注入250mL三角瓶中，测定方法同酯化力的酯含量测定。（把黄色部分去掉改为：加入2-3滴酚酞，用0.1mol/L的NaOH溶液中和至微红后，再加入25ml 0.1mol/L的NaOH。沸水裕中冷凝回流30分钟，冷凝后用0.1（H2SO4）mol/L的H2SO4滴定。）3.7.3 计算试样酯含量（mg/g）= （V1C1V2C2）0.1441000 / （m 50/100）空白液酯含量（mg/g）= （V1C1V0C2）0.1441000 / （m 50/100）式中： C1 ，C2 分别为NaOH和H2SO4标准溶液的浓度（mol/L） V1 加入NaOH标准溶液的体积（mL） V2 滴定试样消耗H2SO4标准溶液的体积（mL） V0 滴定空白消耗H2SO4标准溶液的体积（mL） m 相当5g干曲的曲粉质量（g） 50/100 试样分取倍数 1000 换算成mg酯分解率（）=（空白酯含量-试样酯含量）/空白酯含量 1003.8酸性蛋白酶活力的试验方法3.8.1定义1g固体酶粉（或1mL酶液），在一定的温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为1个酶活单位，以u/g(u/mL)表示。3.8.2福林法3.8.2.1 原理蛋白酶在一定的温度和pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸，在碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。3.8.2.2 试剂和溶液3.8.2.2.1碳酸钠溶液c=0.4mol/L 称取无水碳酸钠42.4g，用水溶解并定容至1000mL。3.8.2.2.2 三氯乙酸c=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g,用水溶解并定容至1000mL3.8.2.2.3缓冲溶液（需用pH计较正） 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶 甲液称取乳酸（80%90%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。 乙液称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取甲液8mL，加乙液1mL，混匀，稀释1倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。3.8.2.2.410g/L酪素溶液 称取酪素1.000g，精确至0.001g，用浓乳酸23滴湿润后，加入80mL乳酸缓冲溶液，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用乳酸缓冲液定容至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为3天。3.8.2.2.5 100ug/mL酪氨酸标准溶液 a.称取预先于105干燥至怛重的L酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。（注：酪氨酸采用上海长江生化制药厂生产。） b.吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到100ug/mL L酪氨酸标准溶液。3.8.3仪器和设备3.8.3.1恒温水浴（400.2）。3.8.3.2 分光光度计3.8.4 分析步骤3.8.4.1标准曲线的绘制a.L-酪氨酸标准溶液管号酪氨酸标准溶液的浓度c/(ug/mL)取100ug/mL酪氨酸标准溶液的体积V/mL取水的体积V/mL000101101922028330374404655055b.分别取上述溶液各1.00mL（需做平行试验），各加0.4mol/L碳酸钠5.00mL、福林试剂1.00mL，置于（400.2）水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，100mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。根据作图或回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（ug），即为吸光常数K值。其K值应在95100范围内。3.8.5 测定3.8.5.1 固体曲浸出液的制备根据测得的试样水份，计算10.00g绝干固体曲的试样量。称取该量试样，置于250mL烧杯中，根据试样水份计算应加水量，将水温调至30，加入烧杯中。再加入10.0mL醋酸醋酸钠缓冲溶液，使固体曲的试样按绝干物质计为10.00g/100mL，充分搅匀，置烧杯于35恒温水浴中保温60min，保温期间每隔15min搅拌一次。浸出液用脱脂棉或多层纱布过滤。滤液应尽快测定，不宜放置。如果在1h内无法测定，可将浸出液暂置冰箱中冷藏，测定时应升至35后使用。（稀释至被试液吸光度值在0.250.40范围内）。3.8.5.2 测定 a.先将酪氨素溶液放入（400.2）恒温水浴中，预热5min。 b.按下列程序操作：试管A（空白）试管B（酶试样，需做3个平行试样）加酶液1.00mL 加酶液1.00mL （400.2）,2min（400.2）,2min加三氯乙酸2.00mL（摇匀） 加酪素1.00（摇匀）（400.2）,10min （400.2）,10min加酪素1.00（摇匀） 加三氯乙酸2.00mL（摇匀）取出静止10min，过滤 取出静止10min，过滤 取1.00mL滤液 取1.00mL滤液 加碳酸钠溶液5.0mL 加碳酸钠溶液5.0mL 加福林试剂1.00mL 加福林试剂1.00mL （400.2） 显色 （400.2）显色于680nm波长，用10mmm比色皿于680nm波长，用10mmm比色皿测其吸光度测其吸光度3.8.5.3计算XAK4/10n=2/5AKn式中：X样品的酶活力（u/g或u/mL）A 样品平行试验的平均吸光度K吸光常数4反应试剂的总体积（mL）10反应时间10min，以1min计N稀释倍数3.8.5.4结果的允许差平行试验相对误差不得超过3%。3.9 细菌的测定3.9.1 实验材料3.9.1.1培养基:牛肉膏 0.5% 氯化钠 0.5%蛋白胨 1.0% 葡萄糖 1.0%琼脂 1.82.0% 调PH至7.27.4后再灭菌.3.9.1.2 主要设备:超净工作台 一台 恒温培养箱 一台3.9.2 实验方法3.9.2.1 分离样品系列稀释:称取2克曲粉,置于250mL三角瓶中,加入100mL生理盐水(或蒸馏水),搅拌成悬浮液,取悬浮液0.5mL,用生理盐水稀释到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7七个稀释度.3.9.2.2倾注平板:取培养皿若干,编号,然后将熔化、冷却到50-55的培养基倒入皿内.培养基凝固后, 选适宜的稀释度,从中吸取0.2mL悬浮液,加入空皿中,用涂玻棒涂匀,将培养皿置于恒温培养箱,于30下培养2天.3.9.2.3 计数取出培养皿,算出3个平皿上同一稀释度的菌落平均数.计数可用记号笔在培养皿背面每数一菌落点一标记,以免计算重复或漏数,也可采用菌落计数器.用标记的方法计算菌落数,可按下列公式进行计算.每mL菌液中的总活菌数等于同一稀释度3副重复的培养皿的菌落平均数乘以稀释倍数再乘以5(5为每皿0.2mL化成1mL的系数).3个稀释度的平均差应是1:10:100的比例,实际操作中应尽量达到这个要求,当然每一稀释度的3副皿更应相近或一致.在这3个稀释度中,要求按30300个菌落/皿的稀释度来正确计数,如这3个稀释度均不能满足,则应将相应的稀释度前后相应移动.3.10 霉菌与酵母菌的测定3.10.1 实验材料 3.10.1.1培养基:马铃薯(去皮) 200克 水 1000mL葡萄糖 2% 琼脂 2%将马铃薯洗净、去皮,称取200克,切成小块,加1000 mL水煮沸半小时,冷却后,用双层纱布滤成清夜,加水补充因蒸发而减少的水分.3.10.1.2主要设备:超净工作台 一台 恒温培养箱 一台3.10.2实验方法3.10.2.1 分离样品系列稀释:称取2克曲粉,置于250mL三角瓶中,加入100mL生理盐水(或蒸馏水),搅拌成悬浮液,取悬浮液0.5mL,用生理盐水稀释到101、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7七个稀释度.3.10.2.2 倾注平板:取培养皿若干,编号, 选适宜的稀释度,从中吸取0.2mL悬浮液,加入空皿中,然后将熔化、冷却到50-55的培养基倒入皿内.培养基凝固后,将培养皿倒置于恒温培养箱,在30下培养2天.3.10.3 计数取出培养皿,算出3个平皿上同一稀释度的菌落平均数.计数可用记号笔在培养皿背面每数一菌落点一标记,以免计算重复或漏数,也可采用菌落计数器.用标记的方法计算菌落数,可按下列公式进行计算.每mL菌液中的总活菌数等于同一稀释度3副重复的培养皿的菌落平均数乘以稀释倍数再乘以5(5为每皿0.2mL化成1mL的系数).3个稀释度的平均差应是1:10:100的比例,实际操作中应尽量达到这个要求,当然每一稀释度的3副皿更应相近或一致.在这3个稀释度中,要求按30300个菌落/皿的稀释度来正确计数,如这3个稀释度均不能满足,则应将相应的稀释度前后相应移动.3.11粗淀粉测定3.11.1 原理淀粉经酸水解生成葡萄糖，用斐林试剂测定生成的糖。3.11.2 试剂和溶液1、20%HCl(质量比)体积比1/12、甲基红1g/L 称取甲基红0.1g溶于乙醇并稀释至100ml3、甲液：称取CuSO45H2O 150g及次甲基蓝0.05g，加水溶解至1000ml，摇匀备用。乙液：称取酒石酸钾钠50g，氢氧化钠54g，亚铁氢化钾4g，加水定容至1000ml，摇匀备用。4、1g/L葡萄糖标准溶液，称取经103105烘干到恒重的无水萄糖糖1.0000g ，加水溶解，并加浓盐酸5ml，用水定溶至1000ml摇匀备用。5、20%NaOH：称取NaOH 20g ,溶解稀释至100ml，（用于调PH值）。6、测定： 称5.000g曲粉，放入250ml的三角瓶中，加100mL20%盐酸，加玻璃珠