脂肪酶产生菌发酵条件的优化.doc

绵阳师范学院 本科生毕业论文 设计 题 目 脂肪酶产生菌 M 6 2 发酵条件的优化 专 业 生 物 技 术 院 部 生命科学与技术学院 学 号 0811420218 姓 名 杜 长 蔓 指 导 教 师 李 俊 刚 答 辩 时 间 2012 年 5 月 论文工作时间 2011 年 7 月 至 2012 年 5 月 脂肪酶产生菌 M 6 2 发酵条件的优化 学 生 杜长蔓 指导老师 李俊刚 摘 要 本文对绵阳师范学院微生物实验室筛选和鉴定的产脂肪酶细菌M 6 2的生长动力学和产酶动力学进行了研究 通过单因素实验和正交试验 对脂 肪酶产生菌M 6 2 摇床发酵产脂肪酶的培养基组成和培养条件进行优化 得出 较佳的产酶培养基组成配方为 1 5 淀粉 0 5 酵母膏为碳源 4 5 豆饼粉 1 5 硝酸铵为最佳的氮源 0 05 磷酸氢二钠和0 15 硫酸镁 最优的发酵条 件为 初始pH7 5 接种量1 5 装液量20ml 250ml 发酵温度35 在转速 180r min下 培养16h 经过优化后发酵液脂肪酶酶活力最高可达到15 60 U ml 较优化前提高了49 57 脂肪酶产生菌M 6 2与国内文献报道的产脂肪酶细菌 相比产酶活力高 对该菌株发酵条件进行优化后 为生产性试验打下了基础 关键词 脂肪酶产生菌 M 6 2 脂肪酶 发酵条件 优化 正交试验 Lipase to produce bacteria M 6 2 Optimization of fermentation conditions Undergraduate Du Changman Supervisor Li Jun Gang Abstract In this paper Laboratory screening and identification of lipase production by bacteria in the M 6 2 growth kinetics and enzyme production kinetics were studied through single factor experiments and orthogonal test the lipase to produce bacteria M 6 2 shaker fermentation lipase medium composition and culture conditions were optimized to come to a better enzyme production medium composition formula 1 5 starch and 0 5 yeast extract as carbon source 4 5 of the soybean powder and 1 5 ammonium nitrate for the best source of nitrogen 0 05 disodium hydrogen phosphate and 0 15 magnesium sulfate Optimal fermentation conditions were initial pH 7 5 1 5 of the inoculum size liquid volume 20ml 250ml fermentation temperature 35 C in the speed 180r min next cultured 16h After optimization of the fermentation broth lipase activity can reach 49 57 to 15 60 U ml compared to before optimization Lipase to produce bacteria M 6 2 and reported in China in the production of lipase bacteria compared to the high activity of enzyme production Of the strain fermentation conditions optimized laid the foundation for the production of test Key words Lipase producing strain M 6 2 lipase fermentation conditions optimization orthogonal test 目 录 1 前言 1 1 1 脂肪酶的概况 1 1 2 国内外脂肪酶的研究概况 2 1 3 本研究的目的及意义 2 2 实验材料和器具 3 2 1 实验菌种 3 2 2 主要实验仪器 3 2 3 实验试剂 3 2 4 培养基 4 3 实验流程 4 4 实验方法 4 4 1 生长曲线的测定 4 4 2 产酶曲线的测定 5 4 3 脂肪酶产生菌 M 6 2 菌体生长的最佳条件的确定 5 4 3 1 PH 对 M 6 2 菌体生长的影响 5 4 3 2 温度对 M 6 2 菌体生长的影响 5 4 3 3 装液量对 M 6 2 菌体生长的影响 6 4 3 4 摇床转速对 M 6 2 菌体生长的影响 6 4 4 脂肪酶培养基的优化 7 4 4 1 脂肪酶培养基单因素条件的优化 7 4 4 2 产脂肪酶培养基的正交试验 7 4 5 脂肪酶发酵条件优化 8 4 5 1 发酵条件单因素条件优化 8 4 5 2 产脂肪酶发酵条件的正交试验 9 5 分析方法 9 5 1 脂肪酶酶活测定与计算方法 9 5 2 酶活测定的原理 9 5 3 酶活的定义 9 5 4 酶活的测定 9 5 5 酶活的计算方法 9 5 6 生物量的测定 10 6 结果与讨论 10 6 1 生长曲线的测定结果 10 6 2 产酶曲线的测定结果 11 6 3 菌体的生长和产酶动力学关系 11 6 4 脂肪酶产生菌 M 6 2 菌体生长最佳条件的确定结果 11 6 4 1 PH 对 M 6 2 菌体生长的影响 11 6 4 2 温度对 M 6 2 菌体生长的影响 12 6 4 3 装液量对 M 6 2 菌体生长的影响 13 6 4 4 摇床转速对 M 6 2 菌体生长的影响 13 6 5 脂肪酶培养基的优化 14 6 5 1 单因素实验 14 6 5 2 正交试验 17 6 6 脂肪酶产生菌 M 6 2 发酵条件的优化 18 6 6 1 单因素实验 18 6 5 2 正交实验 21 6 6 讨论 22 参考文献 24 致 谢 26 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论文 脂肪酶产生菌发酵条件的优化 1 1 前言 1 1 脂肪酶的概况 脂肪酶酶 EC 3 1 1 3 又称三酰基甘油酰基水解酶 acylglycerol hydrolases 1 是一类具有多种催化能力的酶 广泛存在于动植物 植物及微生物中 脂 肪酶具有多种催化能力 能够催化酯类的醇解 水解 转酯 酯化化及酯类的 逆向合成反应 2 3 4 5 6 除此之外 还表现出其他一些酶的活性 如磷脂酶 胆固醇酯酶 溶血磷脂酶 酰肽水解酶活性等 脂肪酶不同活性的发挥依赖于 反应体系的特点 如在油水界面促进酯水解 而在有机相中可以酶促合成和 酯交换 它具有化学选择性和立体异构专一性 反应不需要辅酶 反应条件温 和 副产物少 因此被广泛的应用于轻纺 食品 皮革 化妆品 香料 医药 有机合成 洗涤剂 污水处理等 7 微生物脂肪酶种类多 易发生遗传与变异 繁殖快 pH 值范围及作用温度比动植物脂肪酶广 而且底物专一性高 而且微 生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶 便于工业生产以获得较高纯度的 酶制剂 已成为工业生产脂肪酶的主要来源 并在理论援救方面也具有重要的 意义 脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶 它可作用于甘油三酯的酯键 使甘油 三酯降解为 单酯油酯 甘油二酯 脂肪酸和甘油 作为一种高效无污染的脱 脂剂 脂肪酶在皮革脱脂工艺上尤其具有重要的用途 它可以把不易皂化 难 溶于水的脂肪分解为易溶于水的脂肪酸和甘油 且在碱性条件下使得脂肪更容 易从皮中除去 与传统的乳化法 皂化法和溶剂法脱脂相比较 酶法脱脂皮板 柔软 对皮革质量有明显的提高 脂肪酶还可以作为临床诊断胰腺炎 脂血病 等疾病的依据之一 市场上也已经有作血脂分析用的酶制剂出售 屠宰场 餐饮业 奶制品加工厂等产生的废水中富含易生物降解的有机物 和难生物降解的油脂 普通餐饮废水中油脂含量为 100 831 mg L 8 如果不 经处理直接排放 会造成环境的严重污染 油脂漂浮在水面形成油膜 阻碍氧 气传输 从而威胁水生动植物的生存 9 目前的油脂废水处理工艺有生态处理 和生物处理 生物处理技术包括厌氧 好氧以及二者组合工艺 采用生物反应 器处理油脂废水时 油脂包裹在污泥表面 阻碍了传质作用 降低了底物转化 速率 10 此外 反应器中丝状菌大量繁殖 油脂附着在污泥表面 造成污泥沉 降困难 易导致活性污泥的大量流失 在上述情况下 反应器会出现恶臭气味 溢散和堵塞等运行问题 采用人工湿地等生态法处理油脂废水也很容易出现堵 塞现象 11 目前 成熟的油脂降解技术尚未出现 而国家规定的污水排放标准 日益严格 油脂废水处理技术的改进非常需要 对于饮食习惯中 油占重要部 分的国家 油脂废水处理难题尤为突出 由于微生物资源丰富 生产不受自然环境的影响 可用人工控制来大量生 产目的酶 生产成本低 产酶周期短 是一种经济而实用的方法 脂肪酶在微 生物界分布很广 土壤是微生物的大本营 不同土壤中的微生物所产生脂肪酶 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论文 脂肪酶产生菌发酵条件的优化 2 性能不尽相同 其产生菌主要是 细菌和霉菌 12 已经公布的适用于甘油三 酯加工的不同来源的脂肪酶有 33 种 其中 7 种是细菌 18 种是霉菌 目 前报道的用于产生脂肪酶的微生物主要有无根根霉 Rhizopus arrhizus 13 扩展 青霉 Penicillium expansum 14 假丝酵母 Candidarugosa 15 假单孢菌 Pseudomonas sp 16 等 其中从根霉菌中已分离到 30 多种脂肪酶 且有多种根 霉脂肪酶已被制成商品化酶制剂 17 1 2 国内外脂肪酶的研究概况 脂肪酶作为生物催化剂可催化由不同底物出发的合成和水解反应 这些反 应通常具有对映选择性 区域性或 高底物专一性 使脂肪酶成为有机合成中 重要的生物催化剂 近年来 微生物脂肪酶在各种不同行业得到了广泛的应用 主要是利用脂 肪酶的水解反应 水解反应是指脂肪酶催化脂肪或脂水解为其组成脂肪酸和甘 油或醇 以此应用脂肪酶的方面及行业包括 污水处理 脂肪酸提纯 脂肪水 解 甘油酯结构的测定 生产纸浆和造纸 皮革 加酶洗涤剂 医学应用 食 品成分 底纸脱墨等 其次 应用脂肪酶合成作用的包括低中相对分子质量聚 脂 脂 手性化合物的合成 药物 油脂改性和化妆品等 2003年 中国极地研究中心的俞勇 18 等 从南极乔治王岛冻土来源的76 株 低温细菌中 筛选到13 株低温脂肪酶产生菌 并对其中的BTs10022 菌株进行 了鉴定和酶学性质的初步研究 2004 年邵铁娟 19 等对渤海海泥中筛选到的一株 产低温脂肪酶微生物进行了菌种鉴定及产脂肪酶发酵条件的研究 2006 年 张 金伟 20 等从南极普里兹湾深海沉积物中筛选到一株产低温脂肪酶菌株7195 并 对其进行了鉴定和初步分离纯化 其中南极假丝酵母脂肪酶B 的污水处理方面 用途最为广泛 该酶从南极假丝酵母 Candida antarctica 中分离得到 对非 水溶性和水溶性物质都有极强的催化活性 21 Cihangir 和Sarikaya 22 从土耳其 土样中分离了一株曲霉菌 在pH 5 5 温度30 下培养96 h 获得了酶活为 17U ml的脂肪酶 Azeredo 等 23 针对青霉菌展开液态发酵和固态发酵研究 在 pH 5 5 温度30 下液态发酵96 h 获得了酶活为12 U ml 的脂肪酶 而在湿度 70 温度30 下固态发酵24 h 获得了酶活为17 U g的脂肪酶 尽管目前已经 对脂肪酶产生菌展开了一些研究 但有关产脂肪酶细菌的报道还不多 作者从自 然界中分离和筛选得到一株产脂肪酶细菌M 6 2 显示其可以分泌脂肪酶的高产 菌株 故对其产酶发酵条件进行了优化 使其产酶活力更高 为生产性试验奠定 基础 1 3 本研究的目的及意义 随着对脂肪酶研究的日益深入 其应用领域正日渐拓宽 与此相应 新型 脂肪酶的研究开发就备受关注 24 通过对原有脂肪酶改进或对菌株进行优化培 养可得到新型的脂肪酶 25 本研究的具体目标是对产脂肪酶的细菌 M 6 2 发酵 条件的优化 为中试 生产性试验提供参考数据 从而提高其产脂肪酶酶活力 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论文 脂肪酶产生菌发酵条件的优化 3 使其产酶达到国内先进水平 该菌种如果应用于生产 将对屠宰厂 肉联厂 大型食堂等含油脂的污水厂废水处理带来巨大的社会效益和环境生态效益 2 实验材料和器具 2 1 实验菌种 本实验采用从绵阳六里村屠宰场废水沟的污泥中筛选和鉴定出的的脂肪酶 高产菌株 M 6 2 2 2 主要实验仪器 移液管 10ml 磁力搅拌器 酸式滴定管 25ml 碱式滴定管 25ml SPX 250B 生化培养箱 上海康华生化仪器制造厂出产 HZ 9311K 恒温振荡器 金坛市新航仪器厂出产 SP DJ 系列超净工作台 吴江市净化设备总厂出产 手提式高压灭菌锅 上海三中医疗器械有限公司出产 申溢牌电热不绣钢蒸馏水器 上海三中医疗器械有限公司出产 冰箱 BCD 216E BN 海尔集团公司 电热恒温鼓风干燥箱 DHG 9053A 型 上海精宏实验设备有限公司 高速冷冻离心机 贝克曼库尔特实验系统有限公司广州分公司 电子万用炉 220V AC 1000W 北京市永光明医疗仪器厂 FA1104A 电子天平 上海精天电子仪器有限公司 Sartorius BP211D 电子天平 德国赛多利斯公司 HHS 2 数显恒温水浴锅 上海康华生化仪器制造有限公司 721 型紫外可见分光光度计 Amersham biosciences 2 3 实验试剂 a 0 05mol L 氢氧化钠标准滴定溶液 称取分析纯的氢氧化钠 4 5g 用蒸馏 水溶解定容至 1000ml 约 0 1mol L 氢氧化钠 用邻苯二甲酸氢钾标定 然后 再用蒸馏水稀释至 0 05mol L 储存于附有钠石灰管的玻璃瓶中 b 2 的聚乙烯醇溶液 取 20g 聚乙烯醇加蒸馏水约 1000mL 水浴加热至 溶 冷却后定容至 1000mL 配成 2 的聚乙烯醇溶液 双层纱布过滤备用 c 聚乙烯醇橄榄油乳化液 将橄榄油与上述 2 的聚乙烯醇溶液以 1 3 的 比例混合 用高速组织捣碎机处理 6min 分两次 每次 3min 间隔 5min 即 成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液 d 酚酞试剂 称取酚酞 0 1g 溶于 250ml 90 的乙醇中 e 丙酮 乙醇混合液 将丙酮和乙醇按 1 1 混合 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论文 脂肪酶产生菌发酵条件的优化 4 f 磷酸缓冲液 0 1mol L pH7 5 0 2 mol L 磷酸氢二钠 84ml 0 2 mol L 磷酸二氢钠 16ml 加蒸馏水稀释至 200ml 2 4 培养基 26 斜面培养基 0 2 NaNO3 0 1 Na2HPO4 0 05 KCl 0 05 MgSO4 0 001 FeSO4 3 蔗糖 1 5 2 0 琼脂 种子培养基 0 5 葡萄糖 2 黄豆饼粉 0 5 酵母膏 1 NaNO3 0 1 Na2HPO4 0 05 KCl 0 05 MgSO4 0 001 FeSO4 初始设计发酵培养基 4 黄豆饼粉 1 橄榄油 1 NaCl 0 1 Na2HPO4 0 05 KCl 0 05 MgSO4 0 001 FeSO4 3 实验流程 4 实验方法 4 1 生长曲线的测定 27 1 制配种子培养基和初始发酵培养基 0 1MPa 灭菌 30min 备用 2 将受试菌种在斜面培养基上活化 培养成熟 3 从成熟斜面上挑取 5 环菌苔或孢子接入 7ml 无菌水中 摇匀 吸取 0 5ml 菌悬液接发酵培养基中 一共接 13 瓶 4 将三角瓶放入摇床上 在复筛确定的适合的条件下培养 即 30 180 r min 5 每隔 4h 拿出一瓶 包括 0h 以不接种的培养基作对照 在 560nm 处测吸 光度值 填入下列表 1 1 6 以培养时间为横坐标 吸光度值为纵坐标 作生长曲线 表 1 1 生长曲线的测定 Table 1 1 Determination of growth curve 培养时 间 h 081624324048566472808896 OD 值 实验流程实验流程 生长曲线的测定 脂肪酶发酵条件的优化 脂肪酶培养基的优化 产酶曲线的测定 菌体生长条件的确定 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论文 脂肪酶产生菌发酵条件的优化 5 4 2 产酶曲线的测定 1 制配种子培养基和初始发酵培养基 0 1MPa 灭菌 30min 备用 2 将受试菌种在斜面培养基上活化 培养成熟 3 从成熟斜面上挑取 5 环菌苔或孢子接入 7ml 无菌水中 摇匀 吸取 0 5ml 菌悬液接发酵培养基中 一共接 13 瓶 4 将三角瓶放入摇床上 在复筛确定的适合的条件下培养 即 30 180 r min 5 每隔 4h 取出一瓶 包括 0h 进行酶活力的测定 并填入下列表 1 2 6 以培养时间为横坐标 以酶活力为纵坐标 绘制出产酶曲线 表 1 2 产酶曲线的测定 able 1 2 for enzyme production curve determination 培养时 间 h 04812162024283236404448 酶活 U 4 3 脂肪酶产生菌 M 6 2 菌体生长的最佳条件的确定 4 3 1 pH 对 M 6 2 菌体生长的影响 1 制配种子培养基和初始发酵培养基 0 1MPa 灭菌 30min 备用 2 将受试菌种在斜面培养基上活化 培养成熟 3 从成熟斜面上挑取 5 环菌苔或孢子接入 7ml 无菌水中 摇匀 吸取 0 5ml 菌悬液接发酵培养基中 一共接 11 瓶 4 将三角瓶放入摇床上 在复筛确定的适合的条件下培养 其中 pH 值 分 别为 4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5 7 0 7 5 8 0 8 5 9 0 根据初筛 和复筛确定 即 30 180 r min 5 放在相同的条件下培养 24h 后 以不接种的培养基作对照 在 560nm 处 测吸光度值 填入下列表 1 3 6 以培养的 pH 值为横坐标 吸光度值为纵坐标 作曲线 表 1 3 生长最佳 pH Table 1 3 growth optimum pH 培养 pH 值 4 04 55 05 56 06 57 07 58 08 59 0 OD 值 4 3 2 温度对 M 6 2 菌体生长的影响 1 制配种子培养基和初始发酵培养基 0 1MPa 灭菌 30min 备用 2 将受试菌种在斜面培养基上活化 培养成熟 3 从成熟斜面上挑取 5 环菌苔或孢子接入 7ml 无菌水中 摇匀 吸取 0 5ml 菌悬液接发酵培养基中 一共接 11 瓶 4 将三角瓶放入摇床上 在复筛确定的适合的条件下培养 其中温度分别 为 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 根据初筛和复筛确定 180 r min 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论文 脂肪酶产生菌发酵条件的优化 6 5 放在相同的条件下培养 24h 后 以不接种的培养基作对照 在 560nm 处测吸光度值 填入下列表 1 4 6 以培养温度为横坐标 吸光度值为纵坐标 作曲线 表 1 4 生长最佳温度 Table 1 4 optimum growth temperature 培养 温度 2022242628303234363840 OD 值 4 3 3 装液量对 M 6 2 菌体生长的影响 1 制配种子培养基和初始发酵培养基 0 1MPa 灭菌 30min 备用 2 将受试菌种在斜面培养基上活化 培养成熟 3 从成熟斜面上挑取 5 环菌苔或孢子接入 7ml 无菌水中 摇匀 吸取 0 5ml 菌悬液接发酵培养基中 一共接 11 瓶 4 将三角瓶放入摇床上 在复筛确定的适合的条件下培养 其中装液量 分 别为每 250ml 三角瓶中为 10ml 12ml 14ml 16ml 18ml 20ml 22ml 24ml 26ml 28ml 30ml 根 据初筛和复筛确定 30 180 r min 5 放在相同的条件下培养 24h 后 以不接种的培养基作对照 在 560nm 处 测吸光度值 填入下列表 1 5 6 以培养的 pH 值为横坐标 吸光度值为纵坐标 作曲线 表 1 5 装液量的影响 Table 1 5 installed the influence of the fluid volume 装液 量 ml 1012141618202224262830 OD 值 4 3 4 摇床转速对 M 6 2 菌体生长的影响 1 制配种子培养基和初始发酵培养基 0 1MPa 灭菌 30min 备用 2 将受试菌种在斜面培养基上活化 培养成熟 3 从成熟斜面上挑取 5 环菌苔或孢子接入 7ml 无菌水中 摇匀 吸取 0 5ml 菌悬液接发酵培养基中 一共接 7 瓶 4 将三角瓶放入摇床上 在复筛确定的适合的条件下培养 其中摇床转速 分别为 160 r min 170 r min 180 r min 190 r min 200 r min 210 r min 220 r min 根据初筛和复筛确定 30 5 放在相同的条件下培养 24h 后 以不接种的培养基作对照 在 560nm 处 测吸光度值 填入下列表 1 6 6 以培养的 pH 值为横坐标 吸光度值为纵坐标 作曲线 表 1 6 摇床转速对 M 6 2 菌体生长的影响 Table 1 6 of the rotation speed of the M 6 2 cell growth 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论文 脂肪酶产生菌发酵条件的优化 7 摇床转速 r min 160170180190200210220 OD 值 4 4 脂肪酶培养基的优化 28 4 4 1 脂肪酶培养基单因素条件的优化 4 4 1 1 最佳碳源的优化 以初始设计发酵培养基为基础 分别将橄榄油替换为葡萄糖 淀粉 酵母 膏 麦芽糖 蔗糖 乳糖 接种体积分数均为 1 30 180r min 条件下摇瓶 培养 16h 后 用滴定法测酶活 以确定碳源对发酵产酶的影响 4 4 1 2 复合碳源的优化 以初始设计发酵培养基为基础 分别将橄榄油替换为淀粉和酵母膏 最佳碳 源优化的结果 按不同成分比例混合后 以 1 的含量分别作为培养基中的碳 源 接种体积分数均为 1 30 180r min 条件下摇瓶培养 16h 后 用滴定法 测酶活 以确定碳源对发酵产酶的影响 4 4 1 3 最佳氮源的优化 以初始设计发酵培养基和上述优化的条件为基础 分别将黄豆粉替换为豆 饼粉和硝酸铵 按不同成分比例混合后 以 4 的含量分别作为培养基中的氮源 接种体积分数均为 1 30 180r min 条件下摇瓶培养 16h 后 用滴定法测酶 活 以确定氮源对发酵产酶的影响 4 4 1 4 复合氮源的优化 以初始设计发酵培养基和上述优化的条件为基础 分别将黄豆粉替换豆饼粉 和硝酸铵 最佳氮源优化的结果 接种体积分数均为 1 30 180r min 条 件下摇瓶培养 16h 后 用滴定法测酶活 以确定氮源对发酵产酶的影响 4 4 1 5 最佳无机盐的优化 以初始设计发酵培养基上述优化的条件为基础 分别将无机盐替换为硝酸 钠 磷酸氢二钠 氯化钾 硫酸镁 硫酸铁 接种体积分数均为 0 1 30 180r min 条件下摇瓶培养 16h 后 用滴定法测酶活 以确定无机盐对发酵产酶 的影响 4 4 2 产脂肪酶培养基的正交试验 1 选择豆饼粉 硝酸铵 豆饼粉 硝酸铵 3 1 2 4 6 淀粉 酵母膏 淀粉 酵母膏 3 1 1 2 3 磷酸氢二钠 0 05 0 1 0 15 硫酸镁 0 05 0 1 0 15 这四个因素 每一因 素设定 3 个水平 按下表 1 3 配置 9 组培养基 W V 分装于 250ml 三角瓶中 每瓶 25ml 用 8 层纱布包扎后于 0 1MPa 灭菌 30min 2 接种 挑取斜面菌苔 5 环接入 5ml 无菌水中 摇匀后用无菌移液管吸 取 0 5ml 菌悬液 接到每一组培养基中 接种量要完全一样 3 发酵 将三角瓶放于摇床上 30 180 r min 摇床培养 16h 4 取下摇瓶 立即进行酶活力的测定 比较各组培养基配方的酶活力 确定最佳的培养基配方 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论文 脂肪酶产生菌发酵条件的优化 8 表 1 6 产脂肪酶培养基的正交试验 Table 1 6 Lipase Production orthogonal test medium 因素 水平A 豆饼粉 硝酸 铵 B 淀粉 酵母膏C 磷酸氢二钠 D 硫酸镁 1 2 1 0 05 0 05 2 4 2 0 1 0 1 36 3 0 15 0 15 4 5 脂肪酶发酵条件优化 29 4 5 1 发酵条件单因素条件优化 4 5 1 1 培养基初始 pH 的优化 将优化后的培养基配好后 在复筛的基础上 用 1mol L 的氢氧化钠或 1mol L 的氯化氢分别调节培养基 pH 至 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 根据初 筛和复筛的条件 分别至 250ml 三角瓶中 每瓶 25ml 0 1MPa 灭菌 30min 冷却后以 1 的接种量接种 在 30 恒温摇床上以 180 r min 的转速培养 16h 在同一时间取出 测定其酶活 确定产脂肪酶的的最佳初始 pH 4 5 1 2 培养温度的优化 将优化后的培养基配好后 以上述优化的条件为基础 将培养基分别至 250ml 三角瓶中 每瓶 25ml 0 1MPa 灭菌 30min 冷却后接种 1 的接种量 将接种后的三角瓶在 20 25 30 35 40 45 下 根据初筛和复 筛的条件 摇床培养 180 r min 16h 在同一时间取出 测定其酶活 确定产脂 肪酶的的最佳的培养温度 4 5 1 3 培养基装液量的优化 将优化后培养基配好后 以上述优化的条件为基础 在 250ml 的三角瓶中 分装培养基 装量分别为 10ml 20ml 25ml 30ml 35ml 40ml 根据初筛和 复筛的条件 以 8 层纱布作为瓶口布 0 1MPa 灭菌 30min 1 的接种量 接 种后 摇床培养 180 r min 16h 在同一时间取出 测定其酶活 确定产脂肪酶 的的最佳的装液量 4 5 1 4 摇床转速的优化 将优化后的培养基配好后 以上述优化的条件为基础 在 250ml 的三角瓶 中分装 25ml 的培养基 0 1MPa 灭菌 30min 接种后在 150 r min 160 r min 180 r min 200 r min 220 r min 240 r min 根据初筛和复筛的条件 的摇床中摇瓶培养 16h 在同一时间取出 测定其酶活 确定产脂肪酶的的最 佳的摇床转速 4 5 1 5 接种量的优化 将优化后的培养基配好后 以上述优化的条件为基础 将配好的培养基在 0 1MPa 灭菌 30min 按接种量为 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 根 据初筛和复筛的条件 接种后 摇床中摇瓶培养 16h 在同一时间取出 测定 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论文 脂肪酶产生菌发酵条件的优化 9 其酶活 确定产脂肪酶的的最佳的接种量 4 5 2 产脂肪酶发酵条件的正交试验 经过发酵条件的单因素实验得知 选择以下的因素和水平 设制初始 pH 值 6 5 7 0 7 5 装液量 250ml 三角瓶装液量为 15ml 20m 25ml 接种量 1 5 2 0 2 5 培养温度 25 30 35 四个因素三水平 的正交试验 见表 1 6 表 1 7 因素水平表 Table 1 7 of the factors the level of table 因素水平 A 初始 pH 值B 装液量 mlC 接种量 D 培养温度 16 5151 525 27 0202 030 37 5252 535 5 分析方法 5 1 脂肪酶酶活测定与计算方法 30 采用橄榄油乳化法测定脂肪酶酶活 31 5 2 酶活测定的原理 脂肪酶从橄榄油中分解出脂肪酸 这些脂肪酸又被过量添加的氢氧化钠 中和 然后用氯化氢回滴 可测定出脂肪酸的量 5 3 酶活的定义 以 1 分钟生成 1u mol 的脂肪酸所需的脂肪酶量定义为 1 个酶活力单位 记为 1 个 U 5 4 酶活的测定 在 100ml 的三角瓶中加入 5 0ml 橄榄油乳化液 4 PVA 橄榄油 2 1 及 4 0ml 0 05M 的磷酸缓冲液 pH 7 5 并置于 37 水浴锅中预热 10min 加入 1ml 发酵液滤液 为 V 塞上瓶塞充分振荡 每隔 10min 左右要重新摇动一次 精确保温 30min 后加 10ml 丙酮 乙醇混合液终止反应 加入 10ml 经过标定的 0 05mol L 氢氧化钠溶液 再加 10ml 丙酮 乙醇混合液和 2 滴酚酞 用经过标 定的氯化氢滴定至颜色退去 30s 不变色为终点 记录消耗的氯化氢的量 V1 在相同条件下做空白对照 无须在 37 下保温 30min 加了发酵液滤液后直接 加入丙酮 乙醇混合液即可进行后续操作 其氯化氢消耗的量为 V2 5 5 酶活的计算方法 脂肪酶酶活力 U ml min V2 V1 M V t 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论文 脂肪酶产生菌发酵条件的优化 10 式中 V1 滴定样液所消耗的 HCl 溶液的体积 ml V2 滴定空白样所消耗的 HCl 溶液的体积 ml V 酶液体积 ml t 反应时间 min M 滴定用的 HCl 溶液的浓度 mmol L 5 6 生物量的测定 比浊法测定生物量 32 将活化后的斜面菌株接入种子培养基中 于 30 180 r min 摇床培养 每隔一定时间取样 用 721 型分光光度计在 600nm 下测 其 OD 值 6 结果与讨论 6 1 生长曲线的测定结果 按照上述方法 进行生长曲线的测定 结果见表 2 1 表 2 1 生长曲线的测定 Table2 1 Determination of growth curve 根据表 2 1 绘制出生长曲线 如图 1 所示 图 1 生长曲线 Figure 1 growth curve 从图 1 中可以看出 接种于发酵培养基中的菌体 M 6 2 1 12h 为它的生 长延迟期 12 24h 为它的生长对数期 24 54h 为它的生长稳定期 54h 以后为 它的衰退期 培养时 间 h 061218243036424854606672 OD 值0 30 410 611 301 952 192 202 232 082 011 781 360 84 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论文 脂肪酶产生菌发酵条件的优化 11 6 2 产酶曲线的测定结果 按照上述方法 进行产酶曲线的测定 结果见表 2 2 表 2 2 产酶曲线的测定 table 1 2 for enzyme production curve determination 根据表 2 2 绘制出产酶曲线 如图 2 所示 图 2 产酶曲线 Figure 2 enzyme production curve 由图 2 可知 酶活力在 16h 达到最佳 16 40h 保持稳定 到 40h 后开始下 降 6 3 菌体的生长和产酶动力学关系 图 2 与图 1 比较可知 细菌菌体 M 6 2 在对数时期 12h 24h 产酶达到最高 水平 菌体生长和产酶相偶联 脂肪酶的生成速率随着菌体生长速率的增长而 提高 属于呈正相关型 6 4 脂肪酶产生菌 M 6 2 菌体生长最佳条件的确定结果 6 4 1 pH 对 M 6 2 菌体生长的影响 按照实验方法所述进行实验 结果见表 2 3 表 2 3 生长最佳pH Table 1 3 growth optimum pH 培养 pH 值 4 04 55 05 56 06 57 07 58 08 59 0 OD 值1 451 67 1 891 982 032 252 222 181 961 941 83 根据表 2 3 绘制出曲线 如图 3 所示 培养时 间 h 04812162024283236404448 酶活力 U 003 335 8310 5310 4310 3710 3310 3010 079 978 677 63 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论文 脂肪酶产生菌发酵条件的优化 12 0 0 5 1 1 5 2 2 5 0246810 OD值值 OD值 图 3 生长的最佳 pH Figure 3 the optimal pH of the growth 由图3可知 菌体M 6 2生长的最佳的pH值为6 5 查文献可知 大多数产脂 肪酶细菌最适pH 值6 9 33 34 与此相符合 6 4 2 温度对 M 6 2 菌体生长的影响 按照实验方法所述 进行实验 结果见表 2 4 表 2 4 生长最佳温度 Table 2 4 optimum growth temperature 培养温 度 2022242628303234363840 OD 值1 481 721 942 162 312 222 182 081 961 931 87 根据表 2 4 绘制出曲线 如图 4 所示 图 4 生长最佳温度 Figure 4 best growth temperature 由图4可知 菌体M 6 2生长的最佳的温度为28 查文献可知 大多数显示 脂肪酶细菌的最佳温度范围介于30 40 35 36 与此基本相符合 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论文 脂肪酶产生菌发酵条件的优化 13 6 4 3 装液量对 M 6 2 菌体生长的影响 按照实验方法所述 进行实验 结果见表 2 5 表 2 5 装液量的影响 Table 2 5 installed the influence of the fluid volume 装液 量 ml 1012141618202224262830 OD 值 1 761 982 062 122 342 262 151 971 861 701 64 根据表 2 5 绘制出曲线 如图 5 所示 图 5 装液量对菌体生长的影响 Figure 5 liquid volume on cell growth 由图 5 可知 菌体 M 6 2 生长的最佳的装液量为 18ml 250ml 装液量主要 是和耗氧量有关 而且培养基中的碳源种类对菌体的耗氧量有很大的影响 好 氧速率由大到小依次为 油脂或烃类 葡萄糖 蔗糖 乳糖 本实验的碳源用的是 橄榄油对耗氧量有很大的影响 6 4 4 摇床转速对 M 6 2 菌体生长的影响 按照实验方法所述 进行实验 结果见表 2 6 表 2 6 摇床转速对 M 6 2 菌体生长的影响 Table 2 6 of the rotation speed of the M 6 2 cell growth 摇床转速 r min 160170180190200210220 OD 值 2 032 272 332 292 141 981 83 根据表 2 6 绘制出曲线 如图 6 所示 图 6 摇床转速对 M 6 2 菌体生长的影响 Figure 6 Effect of shaking speed on the M 6 2 cell growth 由图 6 可知 菌体 M 6 2 生长的最佳的摇床转速为 180r min 摇床转速能消 除气泡增加氧传递 摇床转速越小 培养瓶内通气量就少 溶解氧就小 摇床 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论文 脂肪酶产生菌发酵条件的优化 14 转速越大 培养瓶内通气量就大 溶解氧就大 但这对培养瓶和发酵罐的要求 高 而且对菌体也会造成影响 6 5 脂肪酶培养基的优化 6 5 1 单因素实验 6 5 1 1 最佳碳源的优化 按照实验方法所述 进行酶活力的测定 结果如图 7 所示 图 7 碳源对产酶的影响 Figure 7 Effect of carbon sources on enzyme production 由图 7 可知 产脂肪酶培养基中 脂肪酶活力最高的碳源为酵母膏 但因 为其成本较高 在工业化生产时 在考虑到产量和成本的关系 选择以淀粉为 主酵母膏为辅的复合碳源 6 5 1 2 复合碳源的优化 按照实验方法所述 进行酶活力的测定 结果如表 2 7 所示 表 2 7 复合碳源的优化 Table 2 7 composite carbon source optimization 复合碳源酶活 U mL 4 淀粉 对照 7 02 3 5 淀粉 0 5 酵母膏 8 23 3 0 淀粉 1 0 酵母膏 10 16 2 5 淀粉 1 5 酵母膏 10 20 2 0 淀粉 2 0 酵母膏 10 32 1 5 淀粉 2 5 酵母膏 10 36 1 0 淀粉 3 0 酵母膏 10 48 根据表 2 7 绘制出曲线 如图 8 所示 0 2 4 6 8 10 12 酶酶活活力力U ml 酶活力U ml 图 8 复合氮源对产酶的结果 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论文 脂肪酶产生菌发酵条件的优化 15 Figure 8 the results of complex nitrogen source on enzyme production 如图 8 所示 1 碳源中的酵母膏成分含量也多酶活力越高 但酵母膏的 成产成本太高 当碳源成分为 3 0 淀粉 1 0 酵母膏时 即淀粉 酵母膏为 3 1 时 酶活力已接近最高酶活 因此可选择 0 75 淀粉 0 25 酵母膏为碳源 6 5 1 3 最佳氮源的优化 按照上述实验操作后 进行酶活力的测定 结果如图 9 所示 图 9 氮源对产酶的影响 Figure 9 Effect of nitrogen source on enzyme production 由图 9 可知 产脂肪酶培养基中 蛋白胨 尿素 豆饼粉为迟效 氮 硫酸铵和硝酸铵为速效氮 脂肪酶活力最高的氮源为蛋白胨 因为其成本 较高 在工业化生产时 考虑到产量和成本的关系 可选以豆饼粉和硝酸铵为 复合氮源 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论文 脂肪酶产生菌发酵条件的优化 16 6 5 1 4 复合氮源的优化 按照实验方法所述 进行酶活力的测定 结果如表 2 8 所示 表 2 8 复合氮源的优化 Table 2 8 optimization of complex nitrogen source 复合氮源酶活 U mL 3 5 豆饼粉 0 5 硝酸铵 7 23 3 0 豆饼粉 1 0 硝酸铵 10 26 2 5 豆饼粉 1 5 硝酸铵 9 20 2 0 豆饼粉 2 0 硝酸铵 8 37 1 5 豆饼粉 2 5 硝酸铵 7 66 1 0 豆饼粉 3 0 硝酸铵 6 48 0 5 豆饼粉 3 5 硝酸铵 5 45 根据表 2 8 绘制出曲线 如图 10 所示 0 2 4 6 8 10 12 酶酶活活力力U ml 酶活力U ml 图 10 复合氮源对产酶的影响 Figure 10 complex nitrogen source on enzyme production 如图 10 所示 豆饼粉为迟效氮 硝酸铵为速效氮 速效氮有利于菌体生 长 迟效氮有利于产脂肪酶 4 氮源中的豆饼粉成分含量也多酶活力越高 当 氮源成分为 3 0 豆饼粉 1 0 硝酸铵时 这样的组合即有利于菌体生长 又有 利于产脂肪酶 即选择 3 的豆饼粉 1 硝酸时 铵为最佳的氮源 6 5 1 5 最佳无机盐的优化 按照上述实验操作后 进行酶活力的测定 结果如图 11 所示 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论文 脂肪酶产生菌发酵条件的优化 17 图 11 无机盐对产酶的影响 Figure11 of inorganic salts on the enzyme production 由图 11 可知 产脂肪酶培养基中 无机盐磷酸氢二钠和硫酸镁对产酶的影 响最大 6 5 2 正交试验 按实验方法所述 进行培养基的优化 并测定其脂肪酶的酶活 结果见表 2 9 表 2 9 产脂肪酶培养基的正交试验 Table 2 9 Lipase Production orthogonal test medium 因素 A因素 B因素 C因素 D组别 豆饼粉 硝酸铵淀粉 酵母膏磷酸氢二钠硫酸镁 酶活 U 1 12 1 1 10 05 10 05 15 30 2 1 2 2 2 20 1 20 1 15 27 3 1 2 3 3 30 15 30 15 14 83 4 2 4 1 1 20 1 30 15 14 87 5 2 4 2 2 30 15 10 05 14 68 6 2 4 3 3 10 05 20 1 15 12 7 3 6 11 30 15 20 1 14 97 8 3 6 2 2 10 05 30 15 15 73 9 3 6 3 3 20 1 10 05 15 07 K145 4045 1446 1545 05 K244 6745 6845 2145 36 K345 7745 0244 4845 43 K1 15 1315 0515 3815 02 K2 14 8915 2315 0715 12 K3 15 2615 0114 8315 14 极差 R 0 370 220 550 12 因素 主次 顺序 C A B D 优水 平 A3B2C1D3 优组 合 A3B2C1D3 计算各水平酶活力和 Ki 和各水平酶活力和的平均值ki ki Ki 3 其结果见 表2 9 计算各因素列的极差R R kimax kimin R表示该因素在其取值范围内实 验指标变化的幅度 根据极差R的大小 进行因素的主次排列 R越大 表示该因素的水平变化 对实验的影响越大 因此在本实验中这个因素就越重要 反之 R越小 这个 绵阳师范学院 2012 届本科毕业论文 脂肪酶产生菌发酵条件的优化 18 因素就越不重要 由上表可见 通过极差分析 影响因素主次为C A B D 即磷酸氢二钠 豆饼粉 硝酸 淀粉 酵母膏 硫酸镁 通过方差分析 优组合为为A3B2C1D3 所以最佳培养基组成4 5 豆饼粉 1 5 硝酸铵 1 5 淀粉 0 5 酵母膏 0 05 磷酸氢二钠 0 15 硫酸镁 6 6 脂肪酶产生菌 M 6 2 发酵条件的优化 6 6 1 单因素实验 6 6 1 1 培养基初始 pH 的优化 在不同的起始培养基 pH 值下 对菌株 M 6 2 所产生的脂肪酶活