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v 整合素与卵巢癌细胞增殖及凋亡关系的研究【摘要】目的研究v 整合素与人卵巢癌细胞增殖及凋亡之间的关系。方法MTT 法测定细胞增殖情况;吖啶橙荧光染色观察细胞凋亡的形态学变化;流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡。结果抗整合素v亚基抗体对HO-8910细胞有增殖抑制作用,呈时间、剂量依赖性;光镜可观察到细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术检测结果分析,实验组G1/G0期上升,S期和G2/M期下降,细胞凋亡率上升。结论v 整合素可抑制卵巢癌HO-8910细胞凋亡,促进细胞生存。 【关键词】 整合素v亚基 卵巢癌 细胞增殖 细胞凋亡A Study on the Relationship Between αv Integrinand Ovarian Cancer Cell Proliferation and ApoptosisTANG Yan, ZHANG Shuang Department of Obstetrics and Gynaecology,the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,Jinzhou 121001 China【Abstract】 Objective This paper is to study the relationship between α v integrin and ovarian cancer cell proliferation and apoptosis in vitro. Methods The proliferation of cells was detected by MTT method; morphological and ultrastructure changes were observed by acridine orange (AO) staining;cell cycle and apoptotic percentage were analyzed by flow Cytometry(FCM). Results Sc-9969 could inhibit the proliferation of HO-8910 cells as direct relation of concentrations and times.Apoptosis morphology was observed in sc-9969 groups.The flow cytometry showed that the proportion of G1 phase and the apoptotic rate were increased significantly in Sc-9969 groups,and the proportion of S phase and G2/M phase was reduced. Conclusions Integrin α v subunit will be able to delay the apoptosis of Ovarian cancer and promote cell survival. 【Key words】 Integrin αv subunit; Ovarian cancer; cell proliferation; apoptosis 整合素(integrin)是一类细胞表面受体,介导细胞与细胞外基质蛋白(extracellular matrix,ECM)的粘附,参与构成ECM——整合素——细胞骨架跨膜信号传递系统,转导可影响细胞生存、生长、增殖及凋亡的信号。组织特异性的ECM可以延长细胞的生存时间并促进这些细胞的增殖与分化。肿瘤细胞的生存、生长、增殖、分化以及浸润、转移等行为与细胞的粘附行为密切相关。纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)是一种主要的ECM,可与整合素相互作用,诱发一系列细胞内信号转导机制,调节细胞的粘附、迁移、增殖和分化。FN是αv整合素的配体。本实验采取体外无血清培养,以包被在FN底物上的人卵巢癌HO-8910细胞为靶细胞,用不同浓度抗αv整合素单克隆抗体(sc-9969)阻断癌细胞通过αv整合素受体与其配体FN的相互作用,观察细胞凋亡情况,探讨αv整合素与卵巢癌细胞增殖及细胞凋亡的关系。 1 材料与方法1.1 材料人卵巢癌细胞株HO-8910(中科院上海细胞所提供);鼠抗人αv整合素单克隆抗体Sc-9969(Santa公司),纤维粘连蛋白(Sigma公司);胰蛋白酶、RPMI-1640、吖啶橙(AO)、牛血清白蛋白(BSA);胎牛血清(华美生物公司) 。1.2 方法1.2.1 细胞培养人卵巢癌HO-8910细胞株,培养基为RPMI-1640内含10%灭活胎牛血清、37、5%二氧化碳的饱和湿度培养传代。于实验前一天更换无血清培养基培养过夜在含1% BSA的RPMI-1640培养基内培养。1.2.2 基质包被1将FN用PBS稀释成40μg/ml,以0.2ml/cm2的量加至培养板内,372h,1%BSA(PBS稀释)于37,封闭40min。无血清培养基(RPMI-1640)漂洗3次后备用。1.2.3 实验分组共分四组:实验组:加入抗αv整合素单克隆抗体,终浓度分别为1.0μg/ml,5.0μg/ml及10.0μg/ml组;对照组:加入等量的无血清RPMI-1640培养基。(每组设6个复孔)1.3 实验指标的检测1.3.1 MTT试验 取对数生长期的HO-8910细胞,制成浓度为1×105个/ml的单细胞悬液,接种于已用FN包被的96孔培养板中,按上述浓度培养24、48h后加入MTT(5mg/ml)20μl/孔,4h后吸净上清液,加入DMSO20μl/孔,震荡10min,用酶标记光仪在波长为560nm时测定每孔的吸光度(A)值,计算不同浓度抗体对细胞增殖的抑制率抑制率=(对照组A均值-实验组的A均值) /对照组A均值2。1.3.2 AO 染色 取对数生长期的HO-8910细胞,制成浓度为5×105个/ml的单细胞悬液,接种于已用FN包被的24孔培养板中,按上述浓度培养48h后,离心弃上清,用PBS洗3次,加入AO 20μl/孔,作用 30s1分钟后,在荧光显微镜下观察。 取对数生长期的HO-8910细胞,制成浓度为1×106个/ml的单细胞悬液,接种于已用FN包被的6孔培养板中,按上述浓度培养24h后,收集细胞,PBS洗涤,制成单细胞悬液,用70%的冰乙醇4固定12h,用含核糖核酸酶及碘化丙锭的染液染30min,上流式细胞仪进行检测。1.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 取对数生长期的HO-8910细胞,制成浓度为1×106个/ml的单细胞悬液,接种于已用FN包被的6孔培养板中,按上述浓度培养24h后,收集细胞,用AnnexinV-FITC/PI双标记染色后做流式细胞仪双色分析。1.4 统计学处理 采用SPSS13.0 统计软件进行统计分析,所有数据均用xs表示,统计方法采用方差分析及q检验。 2 结果2.1 MTT试验结果 实验结果显示:sc-9969 对HO-8910细胞的生长具有明显的抑制作用, 实验范围内最大抑制率达68.94 %,且抑制作用随药物浓度增加、作用时间延长而增强,呈现剂量、时间依赖性作用, 经统计学检验差异具有显著性意义( P0.01)(见表1 、图1)。表1 实验组和对照组卵巢癌细胞内的吸光度值和增殖抑制率(略) 注:同一作用时间采用方差分析及q检验,*P0.01;同一浓度组采用t检验P0.01 2.2 AO染色 凋亡细胞体积明显缩小,核碎裂,核内可见浓缩边集的染色质,呈新月形或肾形致密浓染的黄绿色染色,荧光亢进 (见图2)。 2.3 Sc-9969对卵巢癌细胞周期分布和凋亡率的影响图1 加入sc-9969后细胞增殖抑制曲线 不同浓度sc-9969作用卵巢癌细胞24h后,与对照组相比,细胞周期分布、凋亡率均发生改变,即G1/G0期细胞比例数上升,S期和G2/M期下降,细胞凋亡率上升,均有显著差异(P0.01),且与sc-9969浓度之间具有剂量依赖性,即呈显著正相关(P0.01) (见表2)。表2 sc-9969对卵巢癌细胞周期分布和凋亡率的影响(略)注:采用方差分析*P0.013 讨论 肿瘤的发生与细胞增殖和凋亡平衡失调有关3。细胞凋亡是不同于细胞坏死的一种死亡过程,又被称为程序性死亡。细胞凋亡是一个非常复杂的过程,受多种因素的调节和制约。肿瘤细胞的生存微环境是非常复杂的,其周围被细胞外基质ECM(如FN)所包围,细胞通过表面的粘附分子与ECM发生粘附,失去粘附能力的细胞更易于走向凋亡。整合素是细胞表面的一种粘附分子,自1987年Hynes提出整合素的概念以来,人们已认识到整合素可以介导细胞粘附、细胞运动等细胞过程,并对其在肿瘤的发生和转移,细胞增殖、细胞凋亡,信号传导的机制方面所起的作用已有较多的了解。Fawi Aoudit等4研究证实,用特异性的阻断抗体阻断细胞后,再次生长于相应的ECM上,就会失去细胞粘附对细胞的保护作用,而易于凋亡。 本实验采用MTT法检测不同时间和剂量的sc-9969对体外培养的HO-8910细胞生长的影响。结果证实sc-9969对HO-8910细胞的增殖具有显著抑制作用,且呈时间、剂量相关性。本试验结果与Goldberg I的报道一致5。 流式细胞仪检测细胞周期显示G1/G0期比例升高,S期、G2/M期降低,且与sc-9969的浓度呈正相关,提示sc-9969具有G1/G0期阻滞作用,使进入S期细胞明显减少,阻碍细胞进入DNA合成期,从而抑制HO-8910细胞生长和诱导凋亡。流式细胞仪检测卵巢癌细胞凋亡率亦表明:sc-9969随浓度的增大其对HO-8910细胞的凋亡率增大(浓度为1.0μg/ml时其凋亡率为1.48%;5.0μg/ml时其凋亡率为1.83%;10.0μg/ml时其凋亡率为2.33%),呈剂量依赖关系,且与对照组(凋亡率为0.23%)比较均具有显著差异(P0.01)。AO染色也观察到了凋亡细胞的形态学变化。 以上的研究表明卵巢癌细胞凋亡与αv整合素受体有密切关系,且αv整合素与其配体纤维粘连蛋白的相互作用能促进细胞生存,当二者被阻断,也阻断了来自细胞外的生存信号的传导,从而有可能会通过使细胞阻滞在G1/G0期,而抑制细胞增殖、导致细胞凋亡。如临床上通过阻断αv整合素与其配体纤维粘连蛋白的相互作用而促进卵巢癌细胞凋亡,可望提高卵巢癌的治疗效果,为卵巢癌的临床治疗提供新的治疗途径。【参考文献】 1吕天敬,张青元,周柔丽.层粘连蛋白与其6整合素受体对人肝细胞表型的调控作用J.中华肿瘤杂志,2003,25(1):31-35.2司徒镇强,吴军正.细胞培养M.西安:世界图书出版公司,1996.138.3Evan G,Littlenood T.Amatter of life and cell death J.Science,1998,281(5381):1317-1322.4Fawi Aoudjit ,Kristiuna Vuori. Integrin siganaling inhibits paclitaxel-induced apoptosis in breast

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