表达型载体.doc

表达型载体 2009-3-5 15:36:02前面已经介绍了基因工程中常用的几种载体系统，包括质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒载体和M13克隆载体等等。这些载体都由三个基本组成部分复制基因、选择标记基因和克隆位点组成。只要具备这三个部分，就可以在基因工程中大显身手。为了使这些载体更有利于外源DNA片段插入后的筛选工作，不断地引进优秀的选择标记基因，使重组载体分子导入寄主细胞后，寄主细胞可以迅速地表现出抗药性、颜色变化或者其它的表型特征的改变。为了DNA操作更方便，不断地将克隆位点由单限制酶位点发展成多克隆位点，更有甚者，将克隆位点区的整个核苷酸序列方向变成相反方向，制造出一对一对仅仅只是多克隆位点区取向相反的载体体系。大部分的改良工作几乎都围绕这几个方面。 但是我们讨论的，仅仅限于用这些载体在较短的时间内获得大量的DNA片段。至于能否获得基因产物，得到基因编码的蛋白质产物，基本上尚未涉及。获得基因，除为了分析这个基因外，另外一个重要目的是为了利用这个基因获得这个基因的产物，这需要使该基因实现表达，这正是本节讨论的内容。1基因表达的基本过程在这里所指的基因表达过程是指遗传信息从DNA到蛋白质的整个过程。从“基因与基因工程”一章中已经知道，这也是中心法则所描述的遗传信息流的过程，它包括转录和转译两大阶段。转录是基因表达的第一步，是遗传信息从DNA分子转移到RNA分子的过程。实质上就是RNA分子的生物合成过程。转录过程是以DNA分子中的一条转录链为模板，在RNA聚合酶的催化作用下进行的一系列的RNA的合成反应。在“基因与基因工程”一章中我们提到过基因结构。如果我们把乳糖操纵子结构简单化，可以把它看成由5端的操纵子结构和随后的基因编码区两大部分组成。基因编码区对应着蛋白质的各个氨基酸。5端的操纵结构是基因的非编码区，对基因表达过程起着重要的控制作用。它主要由操纵子和启动子组成，又叫做启动子区。转录的过程恰如一场“田径赛”。参赛的“运动员”就是RNA聚合酶，其最好的“成绩”就是合成出完整的RNA分子。“运动员”何时可以自由活动，何时开始进入跑道，又何时开始起跑，整个的过程必须听从“裁判员”的指挥。转录的起始是整个过程的第一步。基因转录起始的“信号”全部储存在基因的启动子区内。RNA聚合酶可以随机地与基因的所有的部分结合，但都是十分松散的结合，不妨碍任何基因活动，但一旦同基因的启动子结合，RNA聚合酶马上就进入“工作状态”，在启动区“整装待命”。根据性能的不同，基因启动子区还可以细分为RNA聚合酶的识别位点、结合位点和其它的一些信号序列。绝大多数原核生物的启动子结构都十分相似。一般认为它的识别序列是-35序列，是结合RNA聚合酶的起始位点。RNA聚合酶一旦识别-35序列，就与启动子紧密结合，并逐渐滑向另一个结合位点即-10序列。-10序列与转录起始位点间的距离为510个碱基，基本上都是由TATAATG碱基序列组成，特称为TATA盒，又叫作Pribnow盒。-10序列是给RNA聚合酶定向的序列，使RNA分子的合成按从53的方向进行。同时在这个区段内，DNA双螺旋结构被打开，形成开放型的启动子复合体。直到这时，启动子给RNA聚合酶的“口令”才是“开始”。接着，RNA聚合酶就按照DNA模板合成RNA。基因编码区的3端还有一段非编码序列，这里储存的是转录的终止信号。到了终止信号，完整的mRNA就形成了。转录过程是需要能量的，RNA聚合酶转录到终止信号处，就会“自觉”地终止转录作用，否则会造成浪费，生物体从来不干这样的傻事。基因表达的第二步是转译，是mRNA分子指导蛋白质多肽链合成的过程。转译进行的场所是核糖体。核糖体是一种多组分的细胞质颗粒，含有多种蛋白质合成酶。转译的起始就是核糖体与模板mRNA分子进行识别结合的过程。核糖体内含有rRNA。核糖体依靠rRNA识别mRNA上的核糖体识别序列并与之结合。在大肠杆菌中核糖体识别序列称为SD序列。核糖体与mRNA结合以后就正式开始蛋白质的合成。由起始tRNA运载着起始氨基酸与mRNA上基因的起始密码子“相会”，并在此留下起始氨基酸。接着，下一个氨基酸密码子被带有该氨基酸的tRNA的反密码子识别，同样留下一个氨基酸。被留下的两个氨基酸在核糖体的蛋白质合成酶的作用下形成肽键。转译过程一直按照模板的密码子进行到最后，合成出基因编码区相对应的多肽链。转译的过程又叫做读码的过程，因为tRNA必须要读出模板mRNA的密码子，才能不断地合成出多肽链。所以人们又把基因的编码区叫做开放阅读框架。2基因启动子和表达型载体从上述基因表达的基本过程，可以看到基因的启动子对基因表达所起的巨大作用。同时也可以看到只要RNA聚合酶能识别并结合上启动子，就能进行转录，不管启动子后面的序列来自哪个基因，转录酶都将忠实地把DNA转录成mRNA序列。因此，如果把一般性的克隆载体进行改装，让其装上一个启动子片段，克隆位点就在这个启动子后面，就好象给装上了一个“火车头”，克隆位点就是“车厢的座位”，外源基因就是“搭车的乘客”。那么在克隆位点上插入一个基因的cDNA片段后，这个特殊的基因表达“列车”在整个的表达“旅途”上将受到“沿线”所有关口的认可，从而使重组的载体在寄主细胞内能被寄主的RNA聚合酶识别并结合，进行转录转译作用，理论上是很容易获得该cDNA的多肽产物的。这种带有特殊基因启动子的载体被称作表达型载体。表达型载体，大多数是属于穿梭型的质粒载体。顾名思义，穿梭质粒载体就是一类能在几个（一般是两个）不同生物类群的寄主细胞中生长繁殖的质粒载体。这类质粒载体含有两个或两个以上来自不同生物的复制子。比如有一个穿梭质粒载体，因为它带有大肠杆菌复制子和酵母菌复制子，可以分别在大肠杆菌和酵母菌中生长繁殖。实践证明，在大肠杆菌中进行一系列DNA体外重组和序列分析工作是相当容易的，因为大肠杆菌很容易被操作，步骤简单易行，特别是从大肠杆菌中抽提质粒DNA时破碎细胞之容易是其它任何细胞都无法比拟的。而酵母菌的处理则相当困难，需要大量的酶处理才能制备成原生质体或完全破碎酵母菌细胞。因此若在酵母中进行反复的体外DNA重组，工作量之大是可想而知的，而且成本也相当高。所以构建成穿梭质粒载体后，繁琐的DNA重组工作和一般性的DNA分析工作就在大肠杆菌中进行。直到最后需要研究重组的DNA在酵母中的表达情况时，再导入酵母细胞。相比之下，这就省事多了。3分泌型表达载体基因工程的用途之一是用来制备按其它方法难以生产的大量纯化的蛋白质产物。某一特殊基因在寄主细胞中进行表达，其蛋白质产物可能在细胞内，也可能在细胞之外。这时蛋白质的纯化工作显得十分重要。如何减轻蛋白质纯化工作并使蛋白质的纯化达到最大的效率？这又是人们经常要解决的问题。研究发现，细胞内某些蛋白质合成以后能被运到细胞之外，也就是说被分泌到体外；而有些蛋白质则不能。原因是分泌到体外的蛋白质在体内合成时其一端带有分泌信号肽链，细胞内能认识这种“分泌信号”，结果就给该蛋白质“开绿灯”，从细胞内分泌到细胞外“一路畅通”。起分泌作用的信号肽也是由该肽链的基因编码的，信号肽链的编码区一般位于该基因的启动子和蛋白质编码区之间。由此人们又可以想到如果继续对穿梭表达型载体进行改造，让它在启动子后面插入一段信号肽链的编码。理论上可以获得一个融合的蛋白质。其一端带有分泌信号肽链，而另一端就是我们的目的蛋白质。这一融合蛋白质在细胞内合成后可以象正常的分泌蛋白一样被分泌到细胞之外。这样的载体称为分泌型表达载体。分泌型表达载体给目的蛋白质的纯化带来了很大的方便。主要是因为目的蛋白质能被分泌到细胞外。我们知道细胞内的蛋白质种类是多种多样的，即使象大肠杆菌这类易破碎的细胞，要从细胞内得到一目的蛋白质，有时简直就象大海捞针般困难。除非该目的蛋白质表达量特别大，但这只是理想化的情况。而细胞外培养基的成分就简单多了，大多数是些糖类小分子和一些无机盐。把细胞离心除掉，培养基中大部分蛋白质成分就是目的蛋白质了，对目的蛋白质的纯化相对来说就简单多了。所以无论是从研究价值还是经济实用价值考虑，各类分泌表达型载体的构建工作是很有意义的。4原核生物的表达载体利用原核寄主细胞来表达真核基因是人们经常采取的工作方案。这样人们可以通过类似酵母发酵的办法从原核细胞中收获大量有用的真核基因产物，如人的-干扰素。这时要求真核基因必须处于寄主启动子的有效控制之下。同时为了获得高水平表达，寄主启动子最好是强启动子类型，能够控制外源插入DNA片段在适当的时候进行有效的转录和转译。因为亲缘关系太远，真核基因启动子在原核细胞中受到极大的“压抑”，活性很差或根本不具活性。所以最好是以原核启动子取代真核启动子，以原核生物表达载体来表达真核基因。目前广泛使用的