大鼠胚胎后肾移植的形态学研究.doc

大鼠胚胎后肾移植的形态学研究【摘要】目的观察不同胚龄的大鼠后肾植入同种异体远交系成年宿主体内后的生长变化，探讨大鼠胚胎后肾移植的胚龄选择及血管起源。方法采用光、电镜技术观察胚龄16、20天的大鼠后肾植入同种异体远交系成年宿主体内后肾脏各部的发育情况；应用免疫组织化学的方法观察胚龄20天大鼠后肾内CD31+ 细胞的分布。结果离体后肾移植后可以生长和分化，产生成熟的肾小体；后肾移植后排斥反应强弱与胚龄有关；胚龄20天大鼠后肾内CD31+ 细胞分布在肾小球毛细血管内皮及部分皮质中的间质细胞。结论供体后肾肾小体出现之前是移植的最佳时间；后肾移植物内的毛细血管袢是由其自身的间质细胞分化而来的。 【关键词】 后肾移植 胚龄 肾小体The Morphometric Research of the Rat Embryonic Metanephroi TransplantationZANG Dong-yu, LI Xiao-ming, GUO Min (The First Affiliated Hospital，Liaoning Medical University；Liaoning Medical University，Jinzhou121001 China）【Abstract】 Objective To observe the development of embryonic metanephroi of different age from rat that transplanted into an adult allo-recipient. So to definitude embryonic age selection and vascular genesis in rat embryonic metanephroi transplantation. Methods Light and electron microscope technique were used to observe the development of different part (especially of renal corpuscles) of embryonic metanephroi at embryonic day 16 and day 20 for rat after transplanted into an adult allo-host omentum. Immuno-histochemistry technique was used to observe the distribution of CD31+ cells in embryonic day 20 rat metanephroi. Results Growth and differentiation occurred and mature renal corpuscle emerged for seperated metanephroi by both histoculture and transplantation. Rejection come forth still and is related with the embryonics age. CD31+ cells distributed at corpuscles capillary endothelium and part of the interval cells in cortex for rat embryonic day 20 metanephroi . Conclusions It indicates that its the best occasion for transplantation before glomerulus emerge and it is proved that renal corpusclescapillary of implant differentiated from metanephrois own interval cells. 【Key words】 metanephroi transplantation；embryonic age；renal corpuscle近年来随着胚胎细胞研究的发展，人们发现胚胎组织除具有强大分化潜能外，其抗原性也较弱，因而成为可用于移植的供体器官、组织甚至细胞。尽管国外学者对胚胎后肾移植进行了大量的研究1,2，但对于不同胚龄的后肾移植效果如何尚无人关注，国内学者对胚胎后肾移植更少有问津。本研究以大鼠为实验动物，应用光镜及电镜技术对不同胚龄的后肾移植效果进行了观察，以进一步明确后肾移植胚龄的选择，为后肾移植打下组织学和病理学理论基础，并为寻找肾移植便捷的供体提供一种新的思路。 1 材料和方法1.1 材料 选用体重为200250g的成年健康远交系SD大白鼠24只，雌、雄（3：1）同窝饲养。采用检查阴道栓脱落的方法确定雌鼠受孕时间。以观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚龄0天，以观察到仔鼠出生的最早时间计为生后0天。取孕16、20天的胎鼠，每组8只。受体动物选择体重200250g的成年健康雄性大白鼠。1.2 方法1.2.1 后肾移植 成年雄性大白鼠用10%水合氯醛麻醉，无菌条件下行左侧肾脏切除。孕鼠用10%水合氯醛麻醉，剖腹取胎。将不同胚龄鼠的后肾植入同种成年雄性大白鼠大网膜内。每组移植后的成鼠培养10天，取出移植肾，分别入10%福尔马林和3%戊二醛固定液中固定，光镜、电镜观察。1.2.2 CD31+免疫组织化学观察 取胚龄20天大鼠的后肾→石蜡切片常规脱蜡→3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶→二蒸水冲洗两次→枸橼酸盐煮沸→磷酸缓冲液（PBS）冲洗3次→滴加正常山羊血清封闭液室温20min→滴加一抗（工作浓度1：150）→4过夜→PBS冲洗3次→滴加二抗→37温箱20 min→PBS冲洗3次→滴加SABC→37温箱20 min→PBS冲洗4次→DAB显色→苏木素复染→脱水、透明、封片→光镜下观察。用PBS代替一抗作为阴性对照。 2 结果2.1 大鼠后肾移植结果2.1.1 光镜结构观察 胚龄16天的大鼠胚胎肾脏中，在输尿管芽分支周围出现了小泡体、逗号小体、S小体，但无成熟的肾小体(图1)。将此胚龄的后肾植入成年大鼠大网膜内10天后，可以见到大量成熟的肾小体(图2)，但无明显的淋巴细胞浸润。 胚龄20天的大鼠胚胎肾脏中，有大量成熟肾小体(图3)。将此胚龄的后肾植入成年大鼠大网膜内10天后，可见明显的排斥现象：间质水肿、淋巴细胞浸润，肾小体萎缩，被纤维组织取代(图4)。2.1.2 电镜结构观察 胚龄16天的大鼠后肾植入成年大鼠大网膜内10天后，电镜下可以见到肾小体结构中的内皮细胞、足细胞等，滤过屏障亦发育良好(图5)。2.2 CD31+细胞的分布 胚龄20天大鼠肾脏的石蜡切片经免疫组织化学染色后高倍镜下观察，可以发现CD31+细胞分布在肾小球毛细血管内皮以及部分间质细胞 (图6) 。 3 讨论 胚龄16天的大鼠后肾移植后，排斥反应很轻微，后肾各部位结构发育良好。 Marc3 等在大鼠-大鼠E15后肾移植中发现：电镜下观察可见肾小球毛细血管袢和系膜细胞，高倍视野下可见上皮细胞、内皮细胞、足细胞及具有正常厚薄和外观的基底膜，近曲小管、远曲小管和集合管均可见到，近曲小管有刷状缘。我们的实验结果与Marc等的相符，说明成熟肾小体出现之前的后肾移植后，可以生长、分化并发育，形成正常肾脏的结构。胚龄20天的大鼠后肾移植后，则很快出现排斥反应。由此可见，胚胎后肾并不是完全没有抗原性的，且胚龄越长，排斥反应越明显。表明胚胎后肾移植，其效果随胚龄不同而有所不同。成熟肾小体出现之前的后肾移植后，即使不用免疫抑制剂，其排斥反应亦非常轻微。所以，成熟肾小体出现之前是后肾移植的最佳时间。 关于后肾移植物内肾小体的来源有两种学说4：一种观点认为，肾小体的毛细血管来源于后肾外的细胞，称为外源性后肾组织来源学说；另一种观点认为，肾小体内毛细血管球来源于自己的细胞，即后肾干细胞，故称为内源性后肾组织来源学说。我们的实验结果表明，离体后肾经过组织培养可以存活和发育，并产生毛细血管袢。而CD31+免疫组织化学观察结果发现，CD31+细胞分布在肾小球毛细血管内皮及部分皮质中的间质细胞。CD31+被认为是内皮及内皮前体细胞的重要标记5 。这表明部分间质细胞是内皮的前体细胞，后肾移植物内的毛细血管袢是由其自身的间质细胞分化而来的，所以我们更支持内源性后肾组织来源学说。 尽管在胚胎后肾移植领域的研究已经取得了很大进展，但仍有许多问题有待解决，如APC、MHC-类及类分子究竟在肾脏发生过程中的哪个阶段出现，浸润的淋巴细胞是CD4+还是CD8+等等。这些问题的彻底解决将使我们对胚胎后肾移植有着更为深入的认识。【参考文献】 1Marc R，HammermanTherapeutic promise of embryonic kidney transplantationJNephron Exp Nephrol，2003，93：58-622Abrahamson DR，John PL，Pillion DL，et alGlomerular development in intraocular and intrarenal grafts of fetal kidneysJLab Invest，1991，64：629-6393Marc, Hammerman. Therapeutic promise of embryonic kidney transplantationJNephron Exp Nephrol,2003, 93: 58-62.4Abrahamson DR.Origin of the glomerular basement membrane visualized after in vivo labeling of laminin in newborn rat kidneysJ. J Cell Biol,1985,100:1988.5Naruse K,Fujied M,Miyazaki E,et al.An immunohistochemical study of developing glomeruli in human fetal kidneyJ. Kidney Int，2000，57:1836-1846.图1胚龄16天大鼠肾脏可见输尿管芽分支、S小体，但无成熟肾小体（HE染色100） （略） 图2胚龄16天大鼠肾脏