尼莫地平抑制大鼠烧伤后枯否细胞TNFα的产生.doc

尼莫地平抑制大鼠烧伤后枯否细胞TNF的产生【关键词】烧伤 尼莫地平 枯否细胞 肿瘤坏死因子 【摘要】 目的 探讨钙离子通道阻断剂尼莫地平调控烧伤后枯否细胞（KC）合成释放TNF的可能性，为寻找到一种有效减轻、控制烧伤后过度全身炎症反应的措施提供理论依据。方法 内灌注消化、密度梯度离心法分离培养正常SD大鼠KC，显微荧光分光光度计复合倒置显微镜技术观察烫伤血清作用下单个KC细胞内钙（Ca 2+ i）变化，ELISA方法测定烫伤血清培养的KC上清中TNF浓度变化;SD大鼠行30%TBSA度烫伤，伤后6h分离KC，RNA酶保护分析法测定KC TNFmRNA表达量，并测定血浆TNF水平;观察尼莫地平存在时，上述结果的改变。结果 与对照组相比，烧伤组KCCa 2+ i峰值及培养上清中TNF浓度增加值均显著增加（P0.01），在1M尼莫地平存在时，两者均显著减少（P0.01）。烧伤后6h KC TNFmRNA表达量及血浆TNF水平显著升高，静脉给予尼莫地平（40g?kg -1 ?h -1 ）后，两者均显著减少（P0.01）。结论 烧伤后，KC合成释放TNF，通过细胞内钙离子通道信号传导途径实现。尼莫地平能抑制烧伤后KC TNFmRNA表达，使KC产生TNF明显减少，并下调血浆中TNF的总体水平。关键词 烧伤 尼莫地平 枯否细胞 肿瘤坏死因子Nimodipine can inhibit the production of TNFby kupffer cells in severe burned ratsWang Guangyi，Tian Jianguang，Zhu Shihui，et al.Burn Department，ChanghaiHospital，Shanghai200433.【Abstract】 Objective To study whether nimodipine，a Dihydropyridine-type calcium channel blocker，can inhibit the production of TNFby kupffer cells（KC）and down-regulate its level of plasma after severe burn injury.Methods KCs of normal rats were isolated with portal vein catheter，intrahepatic digestion and density gradient centrifugation.Intracellular calcium concentration（Ca 2+ i）in individual KC after stimulated with postburn serumwas assessed fluorometrically with microspectrofluorometer.Level of TNFin the supernatant of KC cultured with postburn serumwas detected by ELISA.SD rats underwent30%TBSA full thickness burn.Six hours later，KC were isolated and their total RNA was extracted.Level of TNFmRNA was detected by ribonuclease protection assay.Level of plasma TNFwas also detected.Role of nimodipine on above-mentioned effects were observed.Results Compared with that of control group，Ca 2+ i of KC and level of TNFin supernatant in burn group increased significantly.At present of1M nimodipine，however，the numerical value decreased significantly.Compared with that of control group，level of KC mRNA and plasma TNFin burn group also increased significantly.After intravenously injection with nimodipine（40g?kg -1 ?h -1），the numerical value decreased significantly.Conclusion Kupffer cells of rats are activated to secret TNFafter severe burn injury and this process is realized through calcium ion signal transduction channel.Nimodipine can inhibit TNFproduction of KC by preventing its mRNA transcription，down-regulated its level of plasma.Key words burn nimodipine kupffer cells tumor necrosis factor严重烧伤后，大量炎症介质释放，引起全身炎症反应综合征（SIRS）。肿瘤坏死因子（TNF）在SIRS的发生发展中起主导作用，而枯否细胞（KC）是体内TNF的重要来源。钙离子通道作为细胞信号传导的第二信使，在KC的活化中起重要作用。本研究旨在探讨钙离子通道阻断剂的尼莫地平调控KC合成释放TNF的可能性，为寻找到一种能用于烧伤临床治疗的有效减轻、控制过度全身炎症反应的措施提供理论依据。1 材料与方法1.1 烫伤血清的制备 成年SD大鼠（第二军医大学实验动物中心提供，以下同），雌雄不限，体重200250g，随机分成烧伤组和对照组。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，剃躯干毛。烧伤组大鼠浸入98热水中烫背部10s，造成30%TBSA度烧伤（经病理证实）;对照组大鼠用室温水模拟烫伤过程。伤后6h取颈动脉血，分离血清，于-70冻存。1.2 KC的分离和培养 参照Tomioka等方法，采用密度梯度离心法分离正常SD大鼠肝脏KC。将分离的KC接种于96孔板中，每孔细胞数量4.010 5 个，随机分为烧伤组（B组）、对照组（C组）和尼莫地平组（N组），置于5%CO 2 培养箱中。用DMEM培养液37培养24h后，弃去培养液，加入含20%血清的DMEM培养液，其中烧伤组和尼莫地平组培养液中含1M尼莫地平（购自Bayer公司）为烫伤血清，对照组为对照血清。各培养孔于培养开始及3h后取上清，采用ELISA方法进行TNF浓度测定，ELISA试剂盒购自Diaclone公司。将培养3h的TNF浓度测定值减去培养初始浓度，计算TNF的浓度增加值。1.3 单细胞细胞内游离钙离子浓度（Ca 2+ i）的测定 将分离的正常SD大鼠KC贴附于盖玻片上，培养24h后，分别在含20%对照血清、烫伤血清和含1M尼莫地平的烫伤血清条件下，参照Agafonove等方法，采用显微荧光分光光度计复合倒置显微镜（购自Olympus公司）技术，观察单个KCCa 2+ i变化，荧光指示剂为Fura-2/AM（购自Calbiochem公司）。1.4 血浆细胞因子浓度测定 成年SD大鼠18只，体重200250g，随机分成对照组（C组）、烧伤组（B组）、尼莫地平组（N组），每组大鼠各6只。按实验步骤1中的方法烫伤B组和N组大鼠，C组大鼠行假烫处理。大鼠烫伤成功后立即行尾静脉穿刺，按Parkland公式持续液体复苏，其中B组大鼠单纯用乳酸钠林格氏液复苏，N组大鼠复苏液体中含有尼莫地平，用量40g?kg -1 ?h -1 ，C组大鼠行尾静脉穿刺不补液。伤后6h取血，采用ELISA方法进行血浆TNF浓度测定。同时按前述方法分离KC，采用一步法进行KC总RNA的抽提，使用RNA抽提纯化试剂盒（购自上海华舜生物工程公司）。1.5 细胞因子mRNA含量测定 参照Rottman等方法，主要试剂均购自Pharmingen公司。体外转录合成同位素- 32 P标记的RNA探针:包括TNF和内参照GAPDH探针。采用RNA酶保护分析法将RNA探针与KC总RNA杂交，进行非梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显像，用Gel Works1D Advanced v4.01软件进行图像分析，以GAPDH灰度值进行标准量化后，测量TNF条带的相对灰度值。TNFmRNA的表达量，用已经标准量化的GAPDH灰度值的相对值表示（100%）。1.6 统计学处理 TNF含量、Ca 2+ i和mRNA表达量用xs表示，不同组间统计学差异做非配对资料的t检验。2 结果2.1 烫伤血清对KCCa 2+ i的影响 对照组Ca 2+ i峰值为（10.70.89）nM，加入烫伤血清后，Ca 2+ i峰值为（42.11.66）nM，显著高于对照组（P0.01），在1M尼莫地平存在时，Ca 2+ i峰值较单纯烧伤组显著减少（19.90.58）nM（P0.01）（见图1）。图2 尼莫地平对烧伤血清刺激的KCCa 2+ i的影响（n=630个细胞） （图略）2.2 尼莫地平对KC分泌TNF的抑制作用 在含对照血 清的C组，KC培养上清中TNF浓度增加值为（19.323.45）pg/ml，而在含烫伤血清的B组，TNF浓度增加值（437.5669.78）pg/ml显著升高（P0.01），在1M尼莫地平存在时，TNF浓度增加值（42.5414.23）pg/ml较单纯烧伤组显著减少（P0.01）。2.3 尼莫地平对细胞因子mRNA表达的影响 对照组大鼠KC表达一定量的TNFmRNA（0.470.15），烧伤后细胞因子mRNA表达显著升高（1.170.31，P0.01），给予尼莫地平后，细胞因子mRNA表达显著降低（0.860.23，P0.01）。2.4 尼莫地平对大鼠烧伤后血浆TNF水平的影响 对照组大鼠血浆内存在少量TNF（27.659.59）pg/ml，大鼠烧伤后6h血浆TNF水平（610.3595.47）pg/ml显著增加（P0.01），静脉给予尼莫地平后，血浆TNF水平（275.4612.63）pg/ml显著下降（P0.01）。3 讨论严重烧伤后，免疫系统被激活，大量炎症介质释放，导致SIRS的发生。TNF在SIRS的发生、发展中起主导作用。KC作为巨噬细胞中最大的细胞群体，占巨噬细胞总数80%90%，是体内TNF的主要来源，因而在烧伤后SIRS的发生发展中起重要作用。KC作用的发挥是在激活状态下实现的，KC细胞膜上