小鼠胚胎成纤维细胞对Lewis肺癌细胞增殖及凋亡的影响.doc

小鼠胚胎成纤维细胞对Lewis肺癌细胞增殖及凋亡的影响【摘要】目的探讨小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)是否具有肿瘤相关成纤维细胞相似的生物学活性。方法原代培养MEF并经细胞免疫组化法鉴定-SMA的表达情况;收集培养48h无血清高糖DMEM培养基上清并制备条件培养基MEF-CM，根据实验中Lewis肺癌细胞(LLC)细胞培养基不同，分为MEF条件培养基组、DMEM组，应用MTT法检测不同培养基对LLC增殖率的影响;再根据5-Fu作用与否，进一步应用流式细胞仪检测不同培养基对LLC凋亡的影响。结果成功获得原代培养的MEF，表达-SMA; MEF-CM较DMEM能够明显促进LLC细胞增殖(P0.05);MEF-CM较DMEM能够明显抑制LLC细胞凋亡，并能够明显拮抗5-Fu的肿瘤杀伤作用(P0.05)。结论MEF是一种活化的成纤维细胞，具有肿瘤相关成纤维细胞相似的生物学活性，有促进LLC增殖及抑制凋亡的作用，可以作为肿瘤相关成纤维细胞用于肿瘤微环境的研究。 【关键词】 小鼠胚胎成纤维细胞;Lewis肺癌细胞;肿瘤微环境;肿瘤相关成纤维细胞;细胞增殖;细胞凋亡;细胞培养ABSTRACT： ObjectiveTo explore whether or not mouse embryonic fibroblasts (MEFs) have biological activities similar to those of tumor-associated fibroblasts. MethodsMEFs were obtained by primary culture and the expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) was identified by immunohistochemistry. MEF conditioned medium (MEF-CM) was obtained from high glucose DMEM which was cultured for 48 h. On the basis of different medium， the groups were divided into MEF conditioned medium and DMEM ones. The growth rate of Lewis lung carcinoma (LLC) cells was measured by MTT and apoptosis was further measured by flow cytometer according to whether LLC was influenced by 5-Fu. ResultsMEFs were obtained successfully and could express α-SMA. Compared with DMEM， MEF conditioned medium could significantly promote LLC proliferation and inhibit LLC apoptosis (P0.05). MEF conditioned medium could also resist the lethal effect on LLC induced by 5-Fu (P0.05). ConclusionMEF， a kind of activated fibroblasts， has biological activities similar to those of tumor-associated fibroblasts and can promote the proliferation of tumor cells and inhibit their apoptosis. MEF can be used as tumor-associated fibroblasts in research of tumor microenvironment.KEY WORDS： mouse embryonic fibroblast (MEF); Lewis lung carcinoma cell; tumor microenvironment; tumor-associated fibroblasts; proliferation; apopotosis; cell culture小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast， MEF)是一种来源于小鼠胚胎组织的成纤维细胞，在干细胞工程中因其能够分泌多种生长因子支持干细胞分裂增殖，而被用作饲养层细胞1。肿瘤相关成纤维细胞(tumor-associated fibroblasts， TAFs)是肿瘤组织中活化的成纤维细胞，在肿瘤发生、发展的各个阶段发挥重要作用，是肿瘤研究的热点2。TAFs具有取材困难、不易分离纯化的缺点，而MEF易于取材、纯化和培养。本实验培养并观察MEF是否具有TAFs相似的生物活性，以及在体外对Lewis肺癌细胞(Lewis lung carcinoma cell， LLC)的增殖和凋亡的影响，以期获得一种方便易得的TAFs。1材料与方法1.1材料C57BL/6小鼠由西安交通大学实验动物中心提供;LLC购于中科院上海细胞所;兔抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin， α-SMA)多克隆抗体购于美国Abcam公司;SP免疫组化试剂及DAB显色试剂盒购于北京博奥森生物技术公司;MTT试剂、胰蛋白酶购于美国Sigma公司;高糖DMEM培养基购于美国Hyclone公司。1.2方法1.2.1小鼠胚胎成纤维细胞原代培养及传代雌雄C57BL/6小鼠按12比例合笼，无特定病原体(specific pathogen free， SPF)环境下喂养，监测小鼠受孕情况。无菌条件下分离孕13.5 d小鼠胚胎组织，去除头尾部、内脏、四肢，用无钙镁的PBS洗至清亮，用眼科剪剪碎并移入锥形瓶，0.5 g/L胰酶水浴消化8 min，加入2倍体积的完全培养基终止消化，100 μm滤网过滤，获得细胞悬液，1 500 r/min离心3 min，弃上清液，完全培养基再次悬浮细胞，接种至培养瓶中，37 ，50 mL/L CO2条件下培养，34个胚胎可以培养一个75 cm2培养瓶细胞。待原代培养MEF生长融合至80%左右，常规换液后加入2.5 g/L胰酶，按14比例传代。1.2.2细胞免疫组化检测α-SMA表达将原代MEF细胞消化并制备单细胞悬液，调整细胞浓度至5×105/mL，接种至24孔板中，每孔200 μL，待细胞长至60%后，用SP免疫组化试剂盒及DAB显色检测α-SMA表达。步骤严格按试剂盒说明书操作，以光镜下观察到细胞质内有棕褐色细颗粒染色为阳性信号，显微镜下观察并拍照。1.2.3MEF条件培养基的制备将原代培养的MEF细胞传代，待第2天时用PBS清洗细胞，向培养瓶中加入4 mL无血清的高糖DMEM培养基，48 h后收集DMEM培养基，并用0.45 μm滤器过滤，制得条件培养基(MEF conditioned medium， MEF-CM)，4 保存待用。1.2.4MEF条件培养基对LLC增殖的影响消化细胞制备LLC单细胞悬液，调整细胞浓度至5×104/mL，接种至96孔板中，每孔20 μL,6 h后待细胞贴壁后，弃去原培养液，PBS清洗，根据作用于LLC细胞培养基不同，进行实验分组，即MEF条件培养基(MEF-CM)组和DMEM组。每组12孔。继续于37 、50 mL/L CO2、饱和湿度条件下培养，并分别设置12、24、36 h检测时间点。在各时间点时，弃去培养液并加入5 g/L的MTT液20 μL/孔，继续孵育，4 h后即可见有黄黑色甲瓒(formazan)颗粒，吸弃MTT液，勿接触细胞层，加入DMSO 150 μL/孔，摇床上低速振荡10 min后待结晶物溶解后用全自动酶标仪在490 nm波长处，比色法测定各孔吸光度(A)值。1.2.5MEF条件培养基对LLC凋亡的影响消化细胞制备LLC单细胞悬液，调整细胞浓度至5×105/mL，接种至6孔板中，每孔1.5 mL,6 min后待细胞贴壁后，弃去原培养液，PBS清洗，根据5-氟尿嘧啶(5-Fu)作用与否分组，每组5孔：DMEM组、MEF-CM组、5-Fu+DMEM组、5-Fu+MEF-CM组。37 、50 mL/L CO2、饱和湿度条件下培养24 h，按Annexin V-FICT/PI双染细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，流式细胞仪检测各组凋亡率。凋亡率=早期凋亡率+中晚期凋亡率。1.2.6统计学处理结果以均数标准差(x-s)表示，并采用SPSS13.0软件包进行统计分析。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1C57BL/6小鼠受孕及子宫解剖情况68周健康成年C57BL/6小鼠以雌雄比例12合笼后每日观测阴道栓情况，雌鼠全部怀孕，怀孕率100%，无假孕现象。2.2MEF细胞的原代培养及鉴定原代培养的MEF细胞呈星状，细胞突出较多，实验中MEF细胞采用第2代细胞，在MEF细胞质中可见α-SMA的棕色颗粒，即MEF中表达α-SMA(图1)。图1MEF细胞的原代培养及鉴定A：第2代MEF细胞倒置显微镜观察(×200);B：第2代MEF细胞中可见α-SMA表达(×400)。2.3不同培养基对LLC增殖的影响用不同培养基分别作用于LLC 12、24、36 h，同一时间点MEF-CM组的细胞增殖率高于DMEM(P0.05，图2)。2.4不同培养基对LLC凋亡的影响用不同培养基分别作用于LLC 24 h，流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。结果显示，无5-Fu作用下，MEF-CM较DMEM能够明显抑制LLC细胞凋亡(P0.05);有5-Fu作用下，MEF-CM较DMEM能够明显拮抗5-Fu的肿瘤杀伤作用(P0.01)(图3、图4)。图2不同培养基对LLC细胞增殖率的影响3讨论TAFs是肿瘤间质中的主要细胞，它可以分泌多种细胞因子促进肿瘤增殖，并且在肿瘤血管生成、肿瘤转移过程中发挥重要作用，同时TAFs在肿瘤的诊断、治疗中的作用也逐渐受到重视，因此，TAFs已成为目前肿瘤微环境研究中的热点3-5。通过体外实验中的共培养模式可以了解TAFs对肿瘤的增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响;在体内实验中通过TAFs与肿瘤细胞的共注射可了解TAFs对肿瘤形成、转移、血管生成的作用;通过基因敲除或基因插入使得TAFs的某些产物无表达或过表达以研究TAFs特定产物对肿瘤的影响;通过干预有关信号转导途径来研究TAFs与肿瘤之间的作用方式及作用依赖的信号转导途径。图3不同培养基对LLC细胞凋亡率的影响图4不同培养基对LLC细胞凋亡率的影响与MEF-CM组比较，P0.05，*P0.01。在以往的TAFs研究中，细胞来源多是肿瘤组织经过胰酶消化所获得的。同所有的原代培养一样，这样所获得的TAFs含有其他细胞成分，特别是肿瘤细胞无法完全去除而无法获得纯化的TAFs，使得在后续的研究中无法明确成纤维细胞的活性及作用。本实验通过对C57BL/6小鼠妊娠的准确监测，通过消化法原代培养出MEF。通过观测妊娠13.5 d的小鼠胚胎内脏及骨骼没有完全发育，在培养的过程中去除了头颅、四肢及内脏，保证了获得高纯度的MEF，具有取材简单、便于分离纯化的特点。α-SMA是肌成纤维细胞的特异性标志之一6。活化的MEF可以表达α-SMA，TAFs亦表达α-SMA。活化的成纤维细胞分泌的多种生长因子与成纤维细胞可以组成一自分泌环，不断促进或是维持细胞的活化状态。这与损伤修复过程不同。当损伤因素去除后，活化的成纤维细胞则会转变为静止状态，而在肿瘤组织中成纤维细胞一旦活化就会持续该表型3。本实验证实了MEF细胞中存在α-SMA表达，从而说明了MEF细胞为一种活化的成纤维细胞，具有与TAFs相似的生物学活性。在实验中通过收集MEF的条件培养基，作用于LLC细胞，并以普通无血清的DMEM培养基为对照，使用MTT法检测细胞的增殖活性，发现MEF-CM较DMEM培养基能够明显地促进LLC细胞增殖，并且在12、24、36 h等各时间点都表现统计学差异(P0.05)，即MEF细胞能够在体外促进肿瘤细胞的增殖。MEF-CM在促进LLC肿瘤细胞增殖的同时，也抑制肿瘤细胞的凋亡。在使用流式细胞仪检测发现，在没有外源性促凋亡因素的作用下，MEF-CM及DMEM组细胞的凋亡率不同，可能是由于MEF-CM中含有相关的增殖促进因素而使细胞凋亡比例减少。氟尿嘧啶在体外有较强的细胞毒作用，特别是对S期的细胞有明显杀伤作用，可以诱导细胞凋亡7-8，可作为凋亡诱导因素而引发细胞凋亡。在本实验中使用氟尿嘧啶作为凋亡诱发因素，MEF-CM及DMEM培养LLC 24 h，就观测到MEF-CM组的凋亡率明显小于DMEM组。推测MEF-CM中含有拮抗氟尿嘧啶凋亡诱导作用的因素，而使得LLC的凋亡比例明显低于DMEM组。在干细胞工程中，MEF由于能够分泌多种细胞因子，如LIF、FGF、IGF、TGF、PDGF、EGF等，多做为干细胞的饲养层细胞，来促进干细胞的增殖。通过本实验初步证实了MEF为一种活化的成纤维细胞，具有TAFs相似的生物学活性，有促进LLC细胞增殖及抑制凋亡的作用，可以作为TAFs用于肿瘤微环境的研究。【参考文献】 1TAKAHASHI K， YAMANAKA S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors J. Cell， 2006， 126(4)：663-676.2KALLURI R， ZEISBERG M. Fibroblasts in cancer J. Nature Rev Cancer， 2006， 6(5)：392-401.3BHOWNICK NA， NEILSON EG， MOSSES HL. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression J. Nature， 2004， 432(7015)：332-337.4ORIMO A， GUPTA PB， SGROI DC， et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through SDF-1/CXCL12 secretion J. C