鸡新城疫的诊断.ppt

技能训练8鸡新城疫的诊断 掌握鸡新城疫的临床诊断和实验室诊断的方法 实训目标 疑似鸡新城疫病死鸡 剪刀 镊子 病理剖检记录表 工作服 胶靴 围裙 橡胶手套和来苏儿等 9 11日龄SPF鸡胚 恒温箱 照蛋器 蛋盘 接种箱 注射器 1 5ml 针头 中号镊子 剪刀 眼科剪刀和镊子 毛细吸管 橡皮乳头 灭菌平皿 试管 吸管 0 5ml 1ml 5ml 酒精灯 试管架 胶布 蜡 锥子 煮沸消毒器 消毒剂 3 碘酊棉 75 酒精棉 5 石炭酸 离心机 离心管 生理盐水 96孔V型微量血凝集反应板 微量吸液器 混合振荡器 1 鸡红细胞悬液 鸡新城疫弱毒疫苗 鸡新城疫标准阳性血清等 仪器材料 方法步骤 一 ND的临床诊断 二 ND的实验室诊断 一 ND的临床诊断 1 按家禽尸体剖检程序 首先检查鸡的体表组织 然后检查皮下组织 最后打开体腔 暴露整个胸腔和腹腔器官 检查内部组织器官 鸡新城疫主要检查消化道病变 2 将剖检所见填写于病理剖检记录表内 3 根据剖检记录 归纳分析进行初步诊断 二 ND的实验室诊断 1 病毒的分离培养2 病毒的鉴定 1 病毒的分离培养 1 病料采集与处理分离病毒的材料应来自早期病例病鸡扑杀后应用无菌操作采取脾 脑 肺 肝 肾等器官组织混合将病料制成1 5 1 10的乳剂 每毫升加入青霉素10000单位 链霉素10mg 以抑制可能污染的细菌置冰箱中作用2 4h 然后离心沉淀 取其上清液作为接种材料 在这同时 应对接种材料作无菌检查如有细菌生长 应将原始材料再作除菌处理 也可改用细菌滤器过滤除菌 2 鸡胚接种用9 11日龄的SPF鸡胚 如果没有SPF鸡胚 也可用非免疫鸡胚 将上述处理过的材料 取0 1 0 2ml接种于尿囊腔内 接种后以熔化的石蜡将卵壳上的接种孔封闭 继续置温箱内 每日上下午各照蛋一次 连续观察5d 接种24h内死亡的鸡胚 废弃不用 于24h后死亡的鸡胚 立即取出置4 冰箱冷4h以上 气室向上 然后用无菌操作吸取尿囊液 并做无菌检查 尿囊液浑浊应废弃 留下无菌的尿囊液置低温冰箱保存 供作进一步鉴定 在这同时可将鸡胚倾入一平皿内 仔细观察病变 由新城疫病毒致死的鸡胚 胚体全身充血 在胚头 胸 背 翅和趾部有小出血点 尤其以翅 趾部明显 这在诊断上有参考价值 2 病毒的鉴定 1 微量血凝试验 HA 2 微量血凝抑制试验 HI 1 微量血凝试验 HA 一方面判断分离病毒是否具有血凝性 另一方面确定HI试验中所用抗原的HA滴度 用微量移液器向反应板每个孔分别加生理盐水50 l 共加12孔 换一吸头吸取50 l待检病毒液 加于第1孔的生理盐水中 并用移液器挤压3 5次使病毒混和均匀 然后取50 l移入第二孔 混匀后取50 l移入第3孔 依次倍比稀释到第11孔 第11孔中液体混匀后从中吸出50 l弃去 第12孔不加病毒抗原 作对照 换一吸头吸取1 红细胞悬液依次加入1 12个孔中 每孔加50 l 加样完毕 将反应板置于微型振荡器上振荡1min 并放室温 18 20 下作用30 40min 或置37 恒温培养箱中作用15 30min取出 观察并判定结果 结果判定及记录 表示红细胞完全凝集 红细胞凝集后完全沉于反应孔底层 呈颗粒状 边缘不整或锯齿状 而上层液体中无悬浮的红细胞 表示红细胞未凝集 反应孔底部的红细胞没有凝集成一层 而是全部沉淀成小圆点 位于小孔最底端 边缘水平 表示部分凝集 红细胞下沉情况介于 与 之间 新城疫病毒液能凝集鸡的红细胞 但随着病毒液被稀释 其凝集红细胞的作用逐渐变弱 稀释到一定倍数时 就不能使红细胞出现明显的凝集 从而出现可疑或阴性结果 血凝试验 HA HA视频 用上述分离病毒制备4单位病毒 再用标准的阳性血清进行HI试验 用微量移液器向1 12号孔中分别加入50 l生理盐水 换一吸头取标准阳性血清50 l置于第 孔中 挤压3 5次混匀 吸出50 l放入第二孔中 然后依次倍比稀释至第10孔 并将第10孔的液体混匀后取50 l弃去 第11孔为病毒对照 第12孔为盐水对照 用微量移液器吸取稀释好的4个血凝单位的病毒抗原 向1 11孔中分别加50 l 然后 振荡1min 将反应板置室温下作用20min 或在37 恒温培养箱中作用5 10min 取出血凝板 用微量移液器向每一孔中各加入1 红细胞悬液50 l 再将反应板置于微型振荡器上振荡15 30s 混和均匀 将反应板置37 温箱中作用15 30min后取出 观察并记录结果 2 微量血凝抑制试验 HI 结果判断和记录 表示红细胞凝集抑制 高浓度的新城疫抗体能抑制新城疫病毒对鸡红细胞的凝集作用 使反应孔中的红细胞呈圆点状沉淀于反应孔底端中央 而不出现血凝现象 表示红细胞完全凝集 随着血清被稀释 它对病毒血凝作用的抑制减弱 反应孔中的病毒逐渐表现出血凝作用 而最终使红细胞完全凝集 沉于反应孔底层 边缘不整或呈锯齿状