MDA GSH 蛋白方法--陈远华(修订).doc

Beutler改良法测定组织GSH操作规程一、 原理及意义原理：DTNB能被-SH基团还原，产生等克分子的2-硝基-5-巯基苯甲酸，而苯甲酸阴离子在一定PH值条件下呈黄色，在412 nm波长下有吸收峰。意义：还原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）是一种低分子自由基清除剂，它可清除O2 、H2O2、LOOH。GSH是蛋氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种小分子肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，并且是谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽硫转移酶（GST）两种酶类的底物，为这二种酶分解氢过氧化物所必需，能稳定含巯基的酶和防止血红蛋白及其它辅因子受氧化损伤，最近还证明GSH也参与使Vit E恢复到还原态的作用。GSH测定值的高低可间接反映机体发生氧化损伤的程度。二、 器材可见光分光计、7 ml离心管和管架、加样器和枪头三、 试剂 1 mmol/L的GSH（标准品）； 1柠檬酸钠； 二硫双基苯甲酸（dithio-bis-nitrobenzoicacid, DTNB）试剂：用1柠檬酸钠配成终浓度0.04（w/v）； 20三氯醋酸； 0.3 mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4）缓冲液。四、 步骤1、样品处理及试验步骤（下面以肝脏组织为例）称取一定量的肝脏组织于冰冷0.85生理盐水中漂洗，滤纸吸干表面水分，烧杯内剪碎 制备20%组织匀浆液（须用0.85生理盐水或三蒸水） 4000 g离心10 min后取上清液 按上清液:20三氯醋酸（体积比）为2:1混合（加TCA前留取20 l上清液用于Lowry法测蛋白） 混匀，4000 g离心10 min（此步离心要充分，可适当提高离心力） 收集上清液按表2测定。2、按下表1绘制标准曲线（单位：ml）表1 GSH标准曲线的测定GSH（mol/L）010203040501 mmol/L的GSH00.050.10.150.20.25三蒸水0.50.450.40.350.30.25磷酸盐缓冲液4.04.04.04.04.04.0DTNB试剂0.50.50.50.50.50.5混匀，5 min内于412nm比色，以三蒸水调零，以标准GSH浓度为X轴，相应吸光值为Y轴，绘制标准曲线，并求回归方程。3、按下表2操作测定样品GSH（单位：ml）表2 Beutler改良法样品测定操作试 剂测定管空白管待测样品液0.10磷酸盐缓冲液4.44.4DTNB试剂0.50.5三蒸水00.1测得的吸光值代入回归方程，可计算出样品液的GSH浓度。五、 实验结果1、标准曲线结果GSH浓度（mol）00.050.10.150.20.25A值0.0000.1260.2600.3940.5290.666根据上数据测得标准曲线方程为：X(mol)=0.3744898 Y+0.0017227（其中Y为吸光值，标准曲线看Figure 1）Figure 1 GSH标准曲线图六、 注意事项 样品应冰上匀浆，所有步骤尽量保证低温下操作，否则结果偏低； 所有用水均需三蒸水，否则结果偏低； 未经蛋白变性处理的样品在20不宜存放； 反应管内最终PH值必须保证在8.09.0间，否则结果不稳定； 配好的DTNB应在有限期内使用（4下可存1个月）； GSH浓度低时显色快，消退也快；浓度高时显色慢，消退也慢，一般反应15 min后测定（最好不要超过5 min）； 反应总体积可调为2.5 ml。1. 自由基医学研究方法中 “Beutler改良法”。2. Beutler E, Duron O, Kelly BM. Improved method for the determination of blood glutathioneJ. J Lab. Clin. Med. 1963, 61: 882-890.（陈远华） 组织MDA测定操作规程一、原理与意义原理：过氧化脂质降解产物中的丙二醛（Malondialdehyde, MDA）可与硫代巴比妥酸（Thiobarbituric acid, TBA）缩合，形成红色产物硫代巴比妥酸反应物（Thiobarbituric acid-reactive substance, TBARS），在532nm处有最大吸收峰。意义：机体通过酶系统和非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用，使组织细胞受损伤，并由此形成脂质过氧化物，如：MDA等。MDA的高低间接反应机体细胞的氧化损伤程度。二、仪器可见光分光光度计，95水浴锅（或普通铝锅开盖煮沸），低速离心机。7ml塑料试管。三、试剂试剂盒组成配置如下（50T和100T）：50T试剂盒组成与配制： 试剂一：液体10 ml1瓶，室温保存。（缓冲液，天冷时会凝固，每次使用前应37水浴适当加温，直至透明）； 试剂二：液体6 ml1瓶，用时加170 ml双蒸水混匀，4冷藏；（缓冲液，勿接触皮肤） 试剂三：粉剂1瓶，用时将粉剂加到90100的热双蒸水30 ml中，（溶解过程中适当加热），充分溶解后用双蒸水补足30ml再加冰醋酸30ml，混匀，避光冷藏；（冰醋酸自备） 标准品：10 nmol/ml四乙氧基丙烷5 ml1瓶，4冷藏。100T试剂盒组成与配制： 试剂一：液体20 ml1瓶，室温保存。（缓冲液，天冷时会凝固，每次使用前应37水浴适当加温，直至透明）； 试剂二：液体12 ml1瓶，用时加340 ml双蒸水混匀，4冷藏；（缓冲液，勿接触皮肤） 试剂三：粉剂1瓶，用时将粉剂加到95100的热双蒸水60 ml中，（溶解过程中适当加热），充分溶解后用双蒸水补足60ml再加冰醋酸30ml，混匀，避光冷藏；（冰醋酸自备） 标准品：10 nmol/ml四乙氧基丙烷5 ml1瓶，4冷藏。注：冰醋酸又名乙酸，一般医药公司有售，要分析纯级（即AR级，乙酸含量为99以上）四、步骤1、操作表如下标准管标准空白管测定管测定空白管*10 nmol/ml标准品（ml）a*无水乙醇（ml）a*测试样品（ml）a*a*试剂一（ml）a*a*a*a*混匀（摇动几下试管架）试剂二（ml）1.51.51.51.5试剂三（ml）1.51.51.550%冰醋酸（ml）1.5上述混合液混匀，盖紧，于95100水浴锅内反应4060 min（反应时间因MDA含量高低而异，MDA含量低时，时间可相应延长，但每次需一致） 取出后流水冷却，在4000转/分中离心10 min，取上清*，532 nm波长，蒸馏水调零比色。（注：a*，表示所取标准品、无水乙醇、测试样品和试剂一的量，四者均相等，10的肝脏组织匀浆一般取0.1 ml；*，一般标准管、标准空白管和测定空白管每批只需做12个，蛋白不高时，测定空白管可用标准空白管代替；*，吸取上清时尽量小心，避免吸到底下沉淀）五、结果计算与评价1、计算公式： 血清（浆）中MDA含量计算公式：血清（浆）中MDA含量测定管OD测定空白管OD标准品浓度样品测试前（nmol/ml）标准管OD标准空白管OD（10nmol/ml）稀释倍数 组织中MDA含量计算公式：组织中MDA含量测定管OD测定空白管OD标准品浓度蛋白含量（nmol/mg prot）标准管OD标准空白管OD（10nmol/ml）（mg prot/ml）nmol/mg prot为纳摩尔/毫克蛋白六、注意事项 天冷时试剂一会凝固，须水浴加热至透明方可使用； 匀浆样品不宜保存，需当天测试； 样品应冰上匀浆（低温操作）； 反应后离心沉淀要充分，比色时注意不要将沉淀倒入杯中，否则结果偏高； 标准管吸光度减去标准空白管吸光度的值在0.0650.070之间； 本试剂盒4避光保存1年。1. 参见南京建成试剂盒说明书。2. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxidation in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem, 1979; 95(2): 351-358.（陈远华） Lowry法测定组织总蛋白操作规程一、实验原理及意义原理：Lowry法是双缩脲法（Biure T）和福林酚法（olin酚）的结合与发展。其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜蛋白质的络合盐。再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。Lowry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强315倍，约是双缩脲法的100倍。由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。Lowry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理，如：加入少量的十二烷基硫酸钠（SDS）。意义： 实验室测定蛋白浓度可推测蛋白质的总量和纯度； 农牧业、食品加工业和发酵工业蛋白质定量分析也是一种重要手段； 在医学领域，人体体液中总蛋白质和某些特定蛋白质的测定，可作为疾病诊断治疗和病程观察的重要指标。二、仪器试管若干（5 ml）；干净烧杯；秒表；加样器；分光光度计。三、试剂 4 NaCO3：4g稀释至100 ml 0.2 mol/L NaOH：8g NaOH加水至1000 ml 1 CuSO4：0.5g加水至50 ml 2酒石酸钠：1g加水至50 ml 标准液：10 mg牛血清白蛋白加蒸馏水至100 mlA液：按:50:50:1:1混匀，当天使用。B液：50的Folin酚试剂（用双蒸水稀释）四、步骤 取组织匀浆上清液，按下表1绘制标准曲线（单位：ml）表1 Lowry法测蛋白标准曲线管 号012345样品管标 液0.00.250.500.751.01.2510 l(样品)蒸溜水1.251.00.750.500.250.01.240试剂A2.02.02.02.02.02.02.0室温10 min后试剂B0.20.20.20.20.20.20.2立即混匀，室温或37水浴30 min，以0号管为参比，750 nm比色，以蛋白浓度为X轴，相应吸光值为Y轴，绘制标准曲线，并求回归方程。 取样品原液20 l加双蒸水至100 l，从稀释液中取10 l，按上表加样，测得吸光值代入标准曲线求得蛋白含量。五、实验结果分析1、标准曲线值浓度(mM)0255075100A值0.0000.1500.2720.3960.535蛋白标准曲线方程为：X (g)=188.679 Y-1.396（Y为吸光值）六、注意事项 此法的特点是：灵敏度高（最低测定值1 g）； 所有用水需双蒸水或三蒸水； 样品加入量应随蛋白的浓度高低而作相应的调整； Folin试剂只在酸性条件稳定，故当其加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前，还原反