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文档简介
检测蛋白之间相互作用的方法 实验目的 体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用 用于验证两个已知蛋白的相互作用 或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白 原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识 研究发现 许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的 功能上相互独立的结构域 domain 组成的 例如 酵母的转录激活因子GAL4 在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域 DNAbindingdomainBD C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域 transcriptionactivationdomainAD GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列 upstreamactivatingsequence UAS 结合 而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录 但是 单独的DNA结合域不能激活基因转录 单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因 它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能 1 视已知蛋白的cDNA序列为诱饵 bait 将其与DNA结合域融合 构建成诱饵质粒 2 将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合 构建成文库质粒 3 将这两个质粒共转化于酵母细胞中4 酵母细胞中 已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用 但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用 则可激活报告基因的转录 反之 则不能 利用4种报告基因的表达 便可捕捉到新的蛋白质 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法 但它也有自身的缺点和问题 1 它并非对所有蛋白质都适用 这是由其原理所决定的 双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白 都必须能进入细胞核内 因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的 2 假阳性的发生较为频繁 所谓假阳性 即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白 而且部分假阳性原因不清 可能与酵母中其他蛋白质的作用有关 3 在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用 从而影响菌株生长和报告基因的表达 实验原理 利用重组技术将探针蛋白与GST GlutathioneStransferase 融合 融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH Glutathione 亲和结合 因此 当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离 1 GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育 a 单一明确的重组蛋白 b 细胞裂解蛋白混合液 c 体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白 2 混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应4 C2h3 离心弃上清4 沉淀加入2 蛋白LoadingBuffer煮沸 离心 5 取上清进行SDS PAGE电泳 6 考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带 进一步做质谱分析确定沉降
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