《纤维素酶》PPT课件.ppt

纤维素酶概述 李昌灵B090201013发酵工程专业 生物工程学院Dec 25 2009 内容 1背景2纤维素及纤维素酶的介绍3国内外纤维素酶的研究热点 研究背景 能源危机高油价 石油 天然气等化石燃料的枯竭 如石油大约为1180 1510亿吨 大约在2050年左右枯竭 天然气储备估计在131800 152900兆立方米 年开采量维持在2300兆立方米 将在57 65年内枯竭 煤的储量约为5600亿吨 可以供应169年 粮食紧缺全世界饥饿人口 10亿纤维素乙醇原料来源广 作物的秸秆 1 5 1012T 年 大部分以焚烧的形式被处理掉 造成大量资源的浪费和环境污染 价格低 50美分 加仑 美国Novozymes公司 工业用酶的需求增大酶的产值 1 1010美元 年 Worldenergyusagewidthchart 汽油的价格 FLAGPOLICYDURINGTHE1973oilcrisis 1979energycrisis Lineatagasstation June15 1979 全球粮食危机 粮农组织食品价格指数和农产品价格指数 StrawsofCrop 纤维素的分子结构 分子量 1 5 106 1 84 106 相当于11300个葡萄糖残基 这些纤维素分子以氢键构成平行的微晶束 约60个为1束 纤维素的弯曲模型 Hermans 20世纪40年代 提出 纤维素 Cellulose 是植物细胞壁的主要组分之一 占植物秸秆干质量的40 50 纤维素 Cellulose 是由D 吡喃型葡萄糖基经 1 4糖苷键联结而成的直链多糖直链状大分子纤维素折迭起来 形成具有高结晶的基本构成单位 由这种基本构成单位集中起来构成微小的结构单位 再由很多的微小单位构成纤维素 Figure1Hermans式纤维素的椅式结构 纤维素酶的介绍 纤维素酶 指由生物产生的一种多组分的混合蛋白质 在适当的条件下 能使不溶性纤维素材料水解成可溶性糖的生物催化剂的总称 纤维素酶的结构 Fig 1Modelofcellulaseenzyme producedbyT fusca 禾草腥黑粉菌 basedonPDBstructure1JS4 催化活性中心 到两个具有独立活性的结构域 具有催化功能的结构域 Catalyticdomain CD 具有结合纤维素功能的结构域 Cellulosebindingdomain CBD 两者之间由一段高度糖基化的linker相连 整个分子呈楔形 球状核区表示包含催化位点和底物结合位点的CD区 少数没有CBD 目前被阐明的催化结构域T reeseiCBH 的催化域结构 它是由 组成的筒状结构 由5个 螺旋和7条 链组成 活性部位由两个延伸至表面的环 loop 以形成一个隧道状 tunnel 结构 长度大约2nm 包含4个结合位点 水解糖苷键发生在第2和第3结合位点之间 纤维素酶的性状 真菌纤维素酶 以水解酶机制和氧化酶机制降解纤维素 细菌纤维素酶 形成多酶复合体结构又称纤维小体 Cellulosome 而起作用 能够更加彻底有效降解天然纤维素 白色 溶于水 高温失活 最适温度在45 65 之间 受二苯乙烯苷 葡萄糖酸 1 5 内酯等抑制 表1产纤维素酶菌种的特点 纤维素酶的作用机制 纤维二糖酶 C1酶 C 酶 根据酶的作用方式纤维素酶分为 纤维素酶 C 1酶 内切型酶 它从水合非结晶纤维素分子内部作用于 1 4 糖苷键 生成纤维糊精与纤维二糖 C 2酶 外切酶 它从水合性纤维素分子的非还原端作用于 1 4 糖背键 逐步切断 1 4 糖节键生成葡萄糖 纤维二糖酶则作用于纤维二糖 生成葡萄糖 何明清 1994 Shoemaker Goeran和Jinshce等人相继发现 内切葡萄糖酶 纤维二糖水解酶及 葡萄糖苷酶均存在2 4个同功酶 对于这些同功酶的功能 目前尚未见有明确的阐述 因此酶解机理还有待进一步研究和探讨 目前 已发现70种纤维素酶 以上几种酶往往相互协同作用 CharacterofReaction Hydrolysisof1 4 beta D glycosidiclinkagesincellulose licheninandcerealbeta D glucans Fig 2CharacterofHydrolysisReaction 纤维素的水解过程 Fig 3Mechanismofcellulolysis Breakageofthenon covalentinthecellulose Hydrolysisoftheindividualcelluloseitintosmallersugars Hydrolysisofdisaccharidesandtetrasaccharidesintoglucose 纤维素酶的来源 真菌 mainly 木霉属 Trichoderma 曲霉属 Aspergillus 和青霉属 Penicillium 如绿色木霉菌 Trichodermaviride 康宁木霉菌 Trichodermakoningii 黑曲霉 Asp niger 绳状青霉 变幻青霉等 细菌 好氧菌 如纤维单胞菌属 Cellulomonas 纤维弧菌属 Cellvibrio 噬胞菌属 Cytophaga 厌氧菌 厌氧性的芽孢梭菌属 Clostridium 产琥珀酸拟杆菌 Bacteroidessuccinogenes 牛黄瘤胃球菌 Ruminococcusflavefaciens 白色瘤胃球菌 R albus 溶纤维丁酸弧菌 Butyrivibriofibrisolvens 等超古菌 激烈火球菌 Pyrococcusfuriosus 等 放线菌 好氧放线菌 Actinomycetales 生二素链霉菌 Streptomycesambofaciens 高温单孢菌属 Thermomonospora 弯曲高温单孢菌 Thermomonosporacurvata 及假诺卡氏菌属等植物 动物及原生动物 little 蜗牛 snail 蟑螂 cockroaches 等 纤维素酶的应用 纤维素酶 食品生产 医药 生物燃料 造纸 洗涤剂 纺织工业 针对以上不知 国内外研究主要集中在以下几方面 1 菌种选育 构建表达具有较高酶活力的纤维素酶菌株 2 酶功能的改造 通过分子改造来提高酶的功能性 3 通过低成本发酵来生产酶制剂 添加可溶性诱导剂 如槐糖 sophorose 纤维二糖 cellobiose 乳糖 lactose 和寡糖 cellooligosaccharides 纤维素酶在实际应用的不足 1 技术上 纤维素酶对温度 湿度 酸碱度十分敏感 生产纤维素酶在保管 加工等过程中处理不当就会失活 影响应用效果 2 标准上 纤维素酶的质量标准 校验方法标准 特别是添加纤维素酶后的产品质量标准 在我国还是空白 取得的成效与预期的目标相距甚远 原因主要有2个 今后对纤维素酶的研究会重点集中在 纤维素酶高产菌株选育 对菌株进行改造 提高菌株生产能力及酶的活性和稳定性 筛选极端条件下纤维素酶高产菌株 优化发酵条件 改进发酵工艺 降低生产成本 使发酵产物易于分离纯化 纤维素酶的测定方法规范化 包括规定标准菌株 标准测活方法 标准底物等 纤维素酶研究现状 BokJD 等人从Thermotoganeapolitana中分离纯化到2个高热稳定性内切纤维素酶CelA CelB 编码这2个内切纤维素酶的基因已经被鉴定 Bronnenmeiar将一种来源于T maritimaMSB8的高热稳定性外切纤维素水解酶 最适温度为95 pH在6 0 7 5 该酶能水解微晶纤维素 羧甲基纤维素和 葡聚糖形成纤维二糖和纤维三糖 来自S solfataricusMT4的 糖苷酶已被纯化鉴定 该酶是一个同源四聚体 85 以上对各种变性剂有极高抵抗力 编码该酶的基因已在大肠杆菌中克隆和高效表达 用拟南芥 Arabidopsisthaliana 叶片 马铃薯或烟叶来表达热稳定性好的AcidothermuscellulolyticusendoglucanaseE1 1987年 Love在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中克隆了最适生长温度为65 的极端嗜热厌氧菌 Caldocellumsaccharolyticum 的 葡萄糖苷酶 并完成测序 1996年Bergquist克隆的栖热菌耐热纤维素酶的耐热温度为70 1997年美国RBI公司开发的103酶耐热温度100 最适酶促温度70 80 1998年THOMAS克隆到Streptomycesviridosporus的内切纤维素酶基因并成功表达于Pichiapastoris中 2000年SPIRIDONOV尝试用放线菌 Thermobifidafusca 进行体外合成纤维素酶 发现这一过程受celR基因调控 通过对比celR基因突变型与野生型的差别 发现celR为组成型表达基因 其DNA结合活性受翻译后修饰调控 2001年VANSolingen从湖底淤泥中筛选到了生产碱性纤维素酶的放线菌菌株 经16SrDNA测序 初步鉴定为链霉菌属新种 并成功克隆到了纤维素酶基因cel12A 并将其利用大肠杆菌表达 纤维素酶的生产 液态发酵 固态发酵 生产方式 胡奎娟等研究了木霉和黑曲霉混合发酵产木聚糖酶和纤维素酶 结果为 木霉和黑曲霉按4 6同时接种 在84h产纤维素酶活力达到230IU g干物质 木聚糖酶活力达到1308IU g干物质 与两菌纯培养相比 纤维素酶活力提高163 木聚糖酶活力提高79 5 邹水洋等对选育的一株康宁木 Trichodermakoningii QF202进行液态发酵生产纤维素酶和木聚糖酶 通摇瓶培养144h后 滤纸酶活1 49FPU mL 葡萄糖苷酶活0 39U mL 木聚糖酶活174 10U mL 比一种商品纤维素酶的糖化能力及总还原糖产量比商品纤维素酶分别提高了55 和40 葡萄糖产量分别提高了33 和12 纤维素乙醇的生产工艺 pretreatment Cellulosematerial cellulolysis sugarsolution fermentation Distillation Dehydration 95 alcohol over99 5 ethanol cellulase 纤维素生产乙醇及其他化工产品的关键 纤维素的糖化的主要方法酸水解法 酸水解法中 稀酸水解所得糖化率低 高浓度强酸可有效水解纤维素 但其腐蚀性对人体有害 且所需工艺条件苛刻 酶水解法 用纤维素酶水解纤维素 在常温 常压条件下就可以 因此 用纤维素酶降解纤维素是目前纤维素利用研究中的热点 稀酸预处理 酶解法 美国可再生能源实验室开发的发酵工艺 参考文献 1 ZieglerMT ThomasSR DannaKJ Accumulationofathermostableendo 1 4 D glucanaseintheapoplastofArabidopsisthalianaleaves J Mol Breed 2000 6 37 46 2 DaiZY HookerBS AndersonDB etal Improvedplant basedproductionofE1endoglucanaseusingpotato Expressionoptimizationandtissuetargeting J Mol Breed 2000 6 277 285 3 GRAHAML etal CharacteristicsofEnzymesProducedbyRuminococcusJlavefacienswhichDegradePlantCellWalls JournalofGeneralMicrobiology 1979 110 21 27 4 BARBELG etal CellulolyticEnzymeSystemofThermoactinomycessp GrownonMicrocrystallineCellulose APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY 1978 36 4 606 612 5 HARRYJ GILBERT GEOFFREPY HAZLEWOODBacterialcellulasesandxylanases JournalofGeneralMicrobiology 1993 139 187 194 6 FREJ STUTZENBERGER CellulolyticActivityofThermomonosporacurvata OptimalAssayConditions PartialPurification andProductoftheCellulase APPLiEDMlcaosioLoGy 1972 24 1 83 90 7 P 0 OLUTIOLA CellulolyticEnzymesinCultureFiltratesofRhizoctonialamellifera JournalofGeneralMicrobiology 1976 97 251 256 8 A D COUTTS FactorsInfluencingtheProductionofCellulasesbySporotrichumthermophile APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY 1976 36 1 819 825 9 MariamB Sticklen FeedstockCropGeneticEngineeringforAlcoholFuels CROPSCIENCE 2007 47 2238 2246 10 ELAINET EVANS etal InvestigationofanendoglucanaseessentialfortheactionofthecellulasesystemofTrichodermareeseioncrystallinecellulose Journalof GeneralMicrobiology 1992 138 1639 1646 11 ELAINET EVANS InvestigationofanendoglucanaseessentialfortheactionofthecellulasesystemofTrichodermareeseioncrystallinecellulose Journalof GeneralMicrobiology 1992 138 1639 1646 12 Ta TungWey etal MolecularCloningandSequenceAnalysisoftheCellobiohydrolaseIGenefromTrichodermakoningiiG 39 CURRENTMICROBIOLOGY 1994 28 31 39 13 S Zeilinger etal NucleosometransactionsontheHypocreajecorina Trichodermareesei cellulasepromotercbh2associatedwithcellulaseinduction MolGenGenomics 2003 270 46 55 14 T M WOOD etal ObservationsontheComplexInteractionsInvolvedintheEnzymaticHydrolysisofCellulose AppliedBiochemistryandBiotechnology 1984 9 313 315 15 D M PHARR PartialCharacterizationofCxCellulaseandCellobiasefromRipeningTomatoFruits1 PlantPhysiol 1973 51 577 583 16 J L Wang P J Gao PCR mediatedanalysisoftranscriptionofCBHIandIIgenesfromTrichodermapseudokoningiiandPenicilliumjanthinellum BiotechnologyLetters 1999 21 321 324 17 BASILJ MACRIS ProductionandCharacterizationofCellulaseandr GlucosidasefromaMutantofAlternariaalternata APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY 1984 47 3 560 565 18 K MAHALINGESHWABRHAA etal PurificationandcharacterizationofanextracellularP glucosidasefromthethermophilicfungusSporotrichumthermophileanditsinfluenceoncellulaseactivity JournalofGeneralMicrobiology 1993 139 2825 2832 19 THOMASM WOOD SHEILAI McCRAE PurificationandSomePropertiesoftheExtracellularP D GlucosidaseoftheCellulolyticFungusTrichodermakoningii Journalof GeneralMicrobiology 1982 128 2973 2982 20 ERICA JOHNSON etal SaccharificationofComplexCellulosicSubstratesbytheCellulaseSystemfromClostridiumthermocellum APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY 1982 43 5 1125 1132 21 C Thrane etal Substratecolonization straincompetition enzymeproductioninvitro andbiocontrolofPythiumultimumbyTrichodermaspp isolatesP1andT3 EuropeanJournalofPlantPathology 2000 106 215 225 22 T M Wood etal SynergismbetweencomponentsofthecellulasesystemoftheanaerobicrumenfungusNeocallimasUxfrontalisandthoseoftheaerobicfungiPenicilh umpinophilumandl richodermakoningiiindegradingcrystallinecellulose ApplMicrobiolBiotechnol 1994 41 257 261 23 Lakshmikant Cellulosedegradationandcellulaseactivityoffivecellulolyticfungi WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology 1990 6 64 66 24 GEOFFIEYHALLIWELL MOIAMMEDIIAZ InteractionsbetweenComponentsoftheCellulaseComplexofTrichodermakoningiionNativeSub