αvβ6整合素在子宫内膜异位症中的表达及生物学意义.doc

v6整合素在子宫内膜异位症中的表达及生物学意义作者：杨波单位：石家庄市，河北医科大学第四医院妇产科【摘要】 目的 在基因及蛋白水平分析αvβ6整合素在子宫内膜异位症(endometriosis, EM)的在位内膜、异位内膜及对照组正常在位子宫内膜的表达状况，探讨其表达的生物学意义。方法 用半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)、免疫组化法对34例EM患者在位和异位内膜，28例非EM患者的在位子宫内膜αvβ6整合素的表达进行半定量、定位分析，并与EM临床分期、类型及部位相联系。结果 αvβ6整合素基因和蛋白在EM患者异位内膜、在位内膜及对照组正常在位内膜的腺上皮中均有不同程度的表达。异位内膜αvβ6整合素mRNA表达显著高于EM在位内膜(P<0.01)；EM在位内膜αvβ6整合素mRNA表达显著高于对照组正常在位内膜(P<0.01)。EM异位内膜αvβ6蛋白质阳性表达率高于在位内膜(P<0.05)，EM在位内膜阳性表达率高于对照组正常在位内膜（P<0.05）。卵巢子宫异位囊肿壁αvβ6整合素mRNA值与腹膜红色样病变相比差异无统计学意义（P>0.05），2组与宫骶韧带结节αvβ6整合素mRNA值相比差异有统计学意义（P<0.01）。增殖期与分泌期在位内膜αvβ6整合素基因及蛋白的表达比较差异无统计学意义(P0.05)。不同期别αvβ6基因及蛋白表达比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论 αvβ6整合素参与了EM的发病过程，不同部位异位内膜的αvβ6整合素表达量有显著不同。【关键词】 整合素αvβ6 子宫内膜异位症 RTPCR 免疫组织化学The expression of αvβ6 integrin and its biological significance in patients with endometriosisYANG Bo, WU Xiaohua, LI Haili,et al.Department of Obstetrics and Gynecology,The Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011【Abstract】 Objective To explore the biological significance of αvβ6 integrin expression in ectopic and eutopic endometrium in patients with endometriosis(EM). Methods Reverse transcriptase polymerase chain reation (RTPCR) and immunohistochemistry were used to examine the expression of αvβ6 integrin in 34 patients with endometriosis and 28 cases of eutopic endometrium of the control group. Results All glandular epithelial cells of eutopic and ectopic endometrium in endometriosis and eutopic endometrium in the normal control expressed αvβ6 in different degree. The gene expression of αvβ6 in eutopic endometrium of EM group was significantly higher than that of eutopic endometrium of the control group (P<0.01). The gene expression of αvβ6 in ectopic endometrium was significantly higher than that of eutopic endometrium of EM(P<0.01). The positive percentage of αvβ6 integrin in eutopic endometrium of EM group was significantly higher than that in endometrium of the control group(P<0.05). The positive percentage of αvβ6 integrin in ectopic endometrium was significantly higher than that in eutopic endometrium of EM, (P<0.05). There was no significant difference between the gene expression of αvβ6 integrin of ovarian endometrioma and red peritoneal lesion, and both of them were significantly higher than uterosacral ligament nodule(P<0.01). The expression of αvβ6 integrin gene and protein have no significant difference(secretory versus proliferative)(P>0.05). No significant difference was observed between early stage and advanced stage of EM in both levels of protein and gene (P>0.05).Conclusion The upregulated expression of αvβ6 integrin in eutopic and ectopic endometium in EM suggests that αvβ6 integrin may play a role in the development of EM.【Key words】 αvβ6 integrin; endometriosis; RTPCR; immunohistochemistry子宫内膜异位症（endometriosis, EM）是生育年龄女性的常见病及多发病，发病率逐年上升，发病机制至今未明，目前倾向于多因素共同致病。在经血逆流的基础上，异位子宫内膜在腹腔内黏附、种植是发病的关键，黏附是内膜异位病灶形成的第一步。在这一过程中细胞黏附分子起重要作用，而作为黏附分子之一的整合素又起关键作用1。整合素家族是一类由α和β亚单位通过非共价键连接而成的膜表面糖蛋白，介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间相互作用，对细胞黏附、生存、生长、增殖、凋亡起主要调节作用2。目前在EM领域研究最多最深入的整合素是αV家族中的αvβ3。αvβ6整合素是上皮细胞特有的整合素，在伤口愈合、胚胎发育、细胞的恶性转化中表达上调3，其β6亚基可以促进细胞的增殖扩散4，5。为理解αvβ6整合素在EM发病中的作用，本研究分析αvβ6在EM的在位内膜、异位内膜及正常在位子宫内膜的表达，以探讨αvβ6在EM的发病机制中所起的作用。1 材料与方法1.1 研究对象及生物材料 选择2005年12月至2006年12月在河北医科大学第四医院妇产科经腹腔镜或开腹手术后病理检查确诊的34例EM患者为研究组，取同期28例因子宫肌瘤行子宫全切的非EM患者子宫内膜为对照组。患者年龄2248岁，平均年龄39.5岁；月经规律，无内科合并症，术前3个月内未用过激素治疗。采用美国生育协会修正后内异症分期评分法（rAFS）对EM进行分期6。通过术中取材，EM异位内膜共36份；在34例EM患者中，共取得卵巢子宫内膜异位囊肿27份，腹膜红色病变10份，宫骶韧带结节8份（部分EM患者同时取2个部分材料）；同时取得EM患者的在位内膜24份（切除子宫的在位内膜21份，术前刮宫取得的在位内膜3份），其中增殖期10例，分泌期14例。按rAFS分期，34例患者期2例，期6例，期10例，期16例。取正常在位内膜共28份其中增殖期12例，分泌期16例，所有标本术后立即置液氮骤冻（<30 min），-80冰箱储存备用。所有取材均经患者知情同意。1.2 RTPCR检测β6基因的表达1.2.1 总RNA的提取：采用Trizol试剂（美国Promega公司生产）提取，在1琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml溴乙锭)中电泳，在凝胶成像系统中照像。完整的RNA应电泳出28 s、18 s、5 s 3条区带且清晰无降解，其中28 s在宽度和亮度上应是18 s的2倍。1.2.2 鉴定RNA纯度：用无菌去离子水将提取的总RNA溶解液稀释(约250300倍)，在紫外分光光度计上测260 nm和280 nm 2个波长的吸光度(OD260和OD280)，OD260OD280应在1.71.8以上，说明蛋白质污染少。1.2.3 RNA定量：利用OD260值按如下公式计算RNA的量。RNA的量(μg/ml)=OD260×40×稀释倍数（若比色杯宽为0.5 cm，需×2）。1.2.4 半定量RTPCR：RTPCR试剂盒由华美生物工程公司提供。引物设计：根据β6基因序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成。β6引物上游5GGTGGAGCTGGAAGTATTTAGG3，下游5TTATTGGGTCACACTGTT3，扩增长度 501bp。用βactin作为内参照。βactin引物上游5ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG3，下游5CGTACTCCTGCTTGATCCACATCTGC3，扩增长度为838 bp。反应条件：β6温度循环参数：反转录37 60 min，预变性94 10 min，变性94 45 s，退火59 45 s，延伸72 45 s，35个循环后72延伸5 min；βactin温度循环参数：反转录37 50 min，预变性94 5 min，变性95 15 s，退火60 60 s，延伸72 30 s，35个循环后72延伸7 min。在1.5琼脂糖凝胶中电泳30 min，用凝胶成像分析系统照相并分析结果。1.2.5 结果判定：琼脂糖凝胶上出现特异性501 bp的条带，并通过β6 mRNA/βactin的mRNA进行半定量测定β6mRNA的表达水平。1.3 免疫组化检测αvβ6蛋白的表达1.3.1 方法：采用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶连结法 (SP法)。αvβ6整合素蛋白单克隆抗体（克隆号2Q872，购自华美公司），PBS 1200稀释。1.3.2 结果判定：αvβ6阳性染色表现为腺上皮的细胞膜和细胞浆棕黄色细颗粒沉着。阴性切片无着色，见图1。1.4 统计学分析 所有数据应用SPSS 10.0软件进行统计。免疫组化结果各组间阳性率的计算采用χ2检验，RTPCR结果3组数据间的两两比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 EM患者异位内膜、在位内膜及对照组正常在位内膜中αvβ6整合素mRNA及蛋白质的表达 用RTPCR检测β6mRNA，β6的扩增片段为501 bp，内参照βactin的扩增片段为838 bp（图2），以β6/βactin的比值作为其基因相对表达水平，异位内膜为EM不同部位异位灶总和。结果显示αvβ6在EM患者在位内膜、异位内膜及对照组正常在位内膜中均有表达。EM异位内膜β6/βactin值为2.09±1.13，显著高于EM在位内膜0.99±0.67（P<0.01），EM在位内膜与对照组正常在位内膜β6/βactin 值0.25±0.25相比差异有统计学意义（P<0.01）。用免疫组织化学方法检测到αvβ6蛋白质在EM患者异位内膜、在位内膜及对照组正常内膜的腺上皮中均有不同程度的表达。αvβ6蛋白阳性为腺上皮的胞浆及胞膜棕黄色弥漫状着色，呈细小沙粒，弥漫分布于胞膜及胞浆。EM异位内膜αvβ6蛋白阳性表达率（86.4）高于EM在位内膜（62.5），EM在位内膜阳性表达率高于对照组正常在位内膜（32.1），差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。2.2 不同月经周期在位内膜αvβ6整合素mRNA及蛋白质的表达 EM在位内膜中，增殖期β6/βactin值为0.81±0.70，蛋白质阳性表达率为40；分泌期αvβ6整合素β6/βactin值为1.12±0.64，蛋白质阳性表达率为78.6，增殖期与分泌期比较差异无统计学意义（P>0.05）。正常在位内膜增殖期β6/βactin值为0.14±0.20，蛋白质阳性表达率为25；分泌期β6/βactin值为0.25±0.27，蛋白质阳性表达率为37.5，增殖期与分泌期比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。2.3 不同期别EM在位内膜αvβ6整合素mRNA及蛋白质的表达 6例EM期患者中，在位内膜αvβ6整合素β6/βactin值为0.89±0.69，蛋白质阳性率为66.7%；18例期在位内膜患者αvβ6整合素β6/βactin值为1.02±0.68，蛋白质阳性率为72.2%，不同期别EM在位内膜αvβ6基因及蛋白质表达比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。图1 αvβ6整合素在卵巢巧克力囊肿壁的表达（1×400）（略）图2 αvβ6整合素mRNAPCR结果电泳图（略）表1 EM患者的异位内膜、在位内膜及对照组正常在位内膜中αvβ6整合素mRNA及蛋白质的表达（略）注：与正常在位内膜比较，P0.05，P0.012.4 EM患者不同部位异位内膜αvβ6整合素mRNA的表达 卵巢子宫异位囊肿壁β6/βactin值为2.43±1.32与腹膜红色样病变β6/βactin值2.26±1.20相比差异无统计学意义（P>0.05），2组与宫骶韧带结节β6/βactin值0.31±0.19相比差异有统计学意义（P<0.01）。10例腹膜红色样病变因所取标本较少，无法进行蜡块包埋切片，全部用于RTPCR检测。8例宫骶韧带结节仅有2例可见腺上皮，阳性1例，因样本例数较少，未作统计学分析比较。3 讨论3.1 在位内膜中αvβ6整合素的表达及其作用 本研究从蛋白质水平上，分析αvβ6整合素在正常在位子宫内膜和EM患者中的在位内膜及异位内膜的表达，同时从基因水平分析了β6亚基的表达。因为在人体αV亚单位仅与β6亚单位连在一起构成二聚体，笔者至今未发现β6亚单位与其他α亚家族结合的报道，故β6即认为是αvβ67。结果显示，αvβ6整合素在正常在位子宫内膜有不同程度的表达。αvβ6整合素在许多组织的正常上皮不表达或仅微弱表达，在上皮细胞增生分化活跃时出现，主要表达于胚胎发育，组织修复及上皮性肿瘤3。αvβ6整合素在正常在位子宫内膜的表达提示它可能在子宫内膜结构的维持及月经周期的循环生长中起作用。研究表明，EM患者与非EM患者的在位内膜的根本差异是基因差异，在位内膜的基因特质将对逆流入腹腔的内膜是否继续生长起决定作用，此学说即郎氏的在位内膜决定论8。本研究发现，EM患者的在位内膜αvβ6整合素表达高于正常在位子宫内膜，显示EM在位内膜与正常在位内膜间存在明显差异，为EM发病的在位内膜决定论又提供了有力的证据，还提示αvβ6可能在EM的发病中发挥重要作用。αvβ6整合素在EM患者的在位内膜的表达与EM的分期无关，表明在位内膜αvβ6整合素的表达情况，不能反映疾病的进展情况及严重程度。 3.2 异位内膜中αvβ6的表达及其意义 αvβ6整合素在腹膜红色样病变中表达显著高于EM在位内膜，提示：(1)逆流的经血进入腹腔后，腹腔的环境作用于异位内膜细胞并改变了其表型。(2)αvβ6在EM的粘附种植过程中有重要作用。有证据表明，EM患者腹腔液中肿瘤坏死因子α（TNFα）、 IL1、IL6、IL8等细胞因子表达增加9-11，IL8还可以促进整合素介导的异位内膜的黏附和增殖。因此，在这些因素的协同作用下，αvβ6整合素表达上调，介导了脱落内膜细胞的局灶黏附。研究发现，αvβ6整合素还可增加异肿瘤细胞抗凋亡的能力12。不仅如此，细胞培养及动物实验证实αvβ6整合素具有独特的使转染细胞增生扩散的能力，β6亚基特有的胞内区结构决定了这一功能4，5，因此，αvβ6整合素可以提高异位内膜增殖扩散的能力，从而使病灶进一步种植发展。目前大多数学者认为腹膜EM来源于月经期返流的子宫内膜种植，卵巢内异症则来源于卵巢上皮化生，而宫骶韧带结节则可能是苗勒管的残余。不同类型EM病变组织的组织学特点、临床表现、预后均有不同之处13。本研究发现，αvβ6整合素在腹膜红色样病变和卵巢子宫内膜异位囊肿的表达远高于宫骶韧带结节。宫骶韧带结节的腺上皮分化增殖水平最低，所以其αvβ6的表达处于相当低的水平。而腹膜红色病变是早期、活跃的EM病变，具有较高的增殖活性，故αvβ6的表达处于高水平13。值得一提的是卵巢子宫内膜异位囊肿，一般认为是晚期EM病变，通常认为其生长活性已不如腹膜红色病变。而本研究发现其囊壁腺上皮αvβ6的高表达与腹膜红色病变相比无显著差异，提示其腺上皮仍有较高的增殖分化的能力。本研究的前期研究发现，正常卵巢表面上皮不表达或极微弱表达αvβ614。而本组资料显示，卵巢异位囊肿腺上皮高表达αvβ6，提示异位的腺上皮细胞有较强的黏附增殖力和一定程度的细胞转化。尽管EM是良性疾病，但它具有侵袭、转移及复发的生物学特性，与恶性肿瘤相类似。在前期实验研究发现αvβ6整合素在卵巢良性上皮性肿瘤中不表达，在卵巢恶性上皮性肿瘤中普遍表达，其表达量与肿瘤的分期及预后密切相关14。因此αvβ6整合素在卵巢子宫内膜异位囊肿及腹膜红色样病变的高表达，可能是联系EM这种良性病变与其表现出的恶性行为，甚至可能是恶变过程的“分子桥梁”。总之，αvβ6整合素在正常宫内膜内有不同程度的表达，对内膜结构有维持及月经周期的循环起一定作用。αvβ6整合素在EM患者的在位内膜及异位内膜表达上调，提示它在EM的发生发展中起促进及推动作用。αvβ6整合素在盆腔不同部位内膜的表达量与该部的生长性呈正相关。【参考文献】 1 Craig A,Witz MD,Akiyuki Takahashi MD,et al.Expression