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8 7 1 文章编号 1 0 0 0 2 2 0 0 2 0 0 9 1 0 0 8 7 1 0 3 基础医学 p 5 3 及p 16 基因在甲状腺乳头状癌中的表达及意义 王春 石建华1 汪万英2 摘要 目的 探讨p 5 3 及p 1 6 基因在甲状腺乳头状癌 p a p i l l i a r yt h y r o i dc a r c i n o m a P T C 中的表达及临床意义 方珐 采用免疫 组化方法检测1 5 7 例P T C 和3 0 例甲状腺瘤组织中p 5 3 及p 1 6 基因的表达 并进行统计学分析 碚果 P T C 中p 5 3 的l I j 性表达 率明显高于良性肿瘤 P 0 0 0 5 并随着Y F C 病理分级增高而显著增加 P 0 0 1 而凡颈部淋巴结有转移者高于无转移者 P 0 0 5 而P T C 中p 1 6 的阳性表达率明显低于良性肿瘤 P 0 0 0 5 且阳性表达率随着P T C 病理分级增高而显著降低 P 0 0 1 p 1 6 在发生颈部淋巴结转移的乳头状癌巾l I 性表达率与末发生转移的乳头状癌中阳性表达率差异有统计学意义 P 0 0 1 结论 p 5 3 基冈的突变及p 1 6 基因的失表达都可能促进P T C 的发生 发展及其转移 且p 1 6 基因可能在P T C 的中 晚期发挥系要作用 叮作为判断P T C 恶性程度的参考指标 具有重要临床参考价值 关键词 甲状腺肿瘤 甲状腺乳头状癌 p 5 3 p 1 6 免疫组化 中国图书资料分类法分类号 R7 3 6 1 文献标识码 A E x p r e s s i o n so fp 5 3a n dp 1 6a n dt h e i rc l i n i c a ls i g n i f i c a n c ei nt h y r o i dp a p i l l a r yc a r c i n o m a W A N GC h u n l S H IJ i a n h u a l W A N GW a n y i n 9 2 1 D e p a r t m e n to fE n d o c r i n eS e c r e t i o n 2 C e n t r a lL a b o r a t o r y T h eF i r s tA f f i l i a t e dH o s p i t a lo fB e n g b uM e d i c a lC o l l e g e B e n g b uA n h u i2 3 3 0 0 4 C h i n a A b s t r a c t O b j e c t i v e T oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o n so fp 5 3a n dp 1 6i nt h ep a p i l l a r yt h y r o i dc a r c i n o m a P T C a n dt h e i rc l i n i c a l s i g n i f i c a n c e M e t h o d s I m m u n o h i s t o c h e m i s t r yw a gu s e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o n so fp 5 3a n dp 1 6i n1 5 7e a s e so fP T Ca n d3 0c a s e so f t h y r o i dt u m o r R e s u l t s T h ee x p r e s s i o no fp 5 3i nP T Cw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti nb e n i g nt u m o r s P 0 0 0 5 a n dw i t ht h e i n c r e a s eo ft h ep a t h o l o g i c a lg r a d eo fP T C t h ee x p r e s s i o no fp 5 3i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y P 0 0 1 t h ee x p r e s s i o no fp 5 3i nc a s e sw i t h n e c kl y m p hn o d em e t a s t a s i sw a sh i g h e rt h a nt h a ti ne a s e sw i t h o u t P 0 0 5 t h ee x p r e s s i o no fp 1 6i nP T CW a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a n t h a ti nb e n i g nt u m o r s P 0 0 0 5 a n dw i t ht h ei n c r e a s eo ft h ep a t h o l o g i c a lg r a d eo fP T C t h ee x p r e s s i o no fp 1 6w a sr e d u c e d s i g n i f i c a n t l y P 0 0 1 t h ee x p r e s s i o no fp 1 6i ne a s e sw i t hn e c kl y m p hn o d em e t a s t a s i sW i l l 8s i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tc o m p a r e dw i t ht h a t o fc f l s e sw i t h o u t P 0 0 1 C o n c l u s i o n s T h em u t a t i o no fg e n ep 5 3a n dt h el o s se x p r e s s i o no fg e n ep 1 6m a yp r o m o t et h eg e n e s i s p r o g r e s sa n dm e t a s t a s i so fP T C g e n ep 1 6m a yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h em i d d l ea n da d v a n c e ds t a g e so fP T C w h i c hi s o fg r e a t c l i n i c a lv a l u ea n dc a nb eu s e d 邪ar e f e r e n c ei n d e xi nj u d g i n gt h em a l i g n a n td e g r e eo fP T C K e yw o r d s t h y r o i dn e o p l a s m s p a p i l l a r yt h y r o i dc a r c i n o m a p 5 3 p 1 6 i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y 甲状腺癌是最为常见的内分泌恶性肿瘤之一 占头颈部肿瘤的首位 其中甲状腺乳头状癌 p a p i l l i a r yt h y r o i dc a r c i n o m a P T C 最为常见 随着 分子生物学的快速发展 认为肿瘤的产生是由于多 种癌基囚激活 抑癌基囚失活细胞增殖失控造成的 p 5 3 及p 1 6 是抑癌基因中的两个重要基因 其中 p 5 3 抑癌基因是细胞抑癌基因中被研究最广泛和深 入的摹囚之一 其异常儿乎存在于人类所有的肿瘤 而p 1 6 是近年来新发现的一种直接参与细胞周期调 控的抑癌基因 它在人类多种肿瘤中起重要作用 故 研究p 5 3 p 1 6 基因与甲状腺癌的发生 发展及预后 的关系有较大的意义 本研究应用免疫组化方法检 收稿开期 2 0 0 8 1 2 2 3 作者 争位 蚌埠医学院第一附属医院1 内分泌科 2 中心实验宦 安徽蚌埠2 3 3 0 0 4 作者简介 王春 1 9 8 2 一 男 硕士研究生 通讯作者 石建华 研究生导师 主任医师 教授 测P T C 组织中p 5 3 和p 1 6 基冈的表达 探讨二者对 于P T C 发牛 发展 浸润 转移的影响 对甲状腺癌 的诊疗具有重要临床意义 1 材料与方法 1 1 材料选择我院肿瘤外科手术切除并经病理 组织学确诊的乳头状癌标本1 5 7 例为恶性组 并按 病理分级 其中乳头状癌I 级4 2 例 级6 7 例 级4 8 例 有颈部淋巴结转移者7 5 例 无转移者 8 2 例 另取甲状腺瘤3 0 例为对照组 复阅七述患 者的病理切片 重新切片 厚度4 斗m 1 2 试剂 一抗分别为鼠抗人p 5 3 单克隆抗体 产品编号M A B 0 1 4 2 克隆号D O 7 p 1 6 单克隆抗 体 产品编号M A B 0 2 2 3 克隆号J 8 及免疫组化S P 试剂盒为即用型 均为福州迈新公司产品 1 3 方法 1 3 1 免疫组化S P 法检测p 5 3 p 1 6 基因表达 万方数据 8 7 2 石蜡切片经二甲苯脱蜡和乙醇梯度脱水后 蒸馏水 冲洗3 遍 每张切片滴加3 H O 阻断内源性过氧 化物酶活性 室温孵育1 0m i n 蒸馏水冲洗3m i n 3 次 抗原修复 将p H6 0 柠檬酸盐修复液加热煮 沸 将切片放入 修复1 0m i n 将切片取出 自然冷 却 蒸馏水冲洗2 遍 0 0 1m o l LP B S 缓冲液冲洗 2 遍 切片卜滴加一抗 3 7c C 孵育3 0m i n 4 过夜 阴性对照以P B S 代替一抗 P B S 冲洗3m i nX3 次 切片上滴加二抗 3 7 孵育3 0m i n P B S 冲洗 3m i n 3 次 切片上滴加新鲜配制的D A B 溶液 显 色3 5m i n 显微镜下 观察胞质和 或 胞核内出 现棕黄色颗粒为阳性细胞 自来水冲洗 苏木素复 染 中性树胶封片 1 3 2 结果判断p 5 3 及p 1 6 基因的阳性表达部 位均主要在细胞核 阳性信号呈棕黄色 根据染色 强度及显色癌细胞的比例将染色结果分为阴性 一 弱阳性 强阳性 1 按切片中细 胞显色有无及深浅评分 无显色为0 分 棕黄色为 1 分 棕褐色为2 分 2 根据显色癌细胞的比例记 分 7 1 为 3 分 每例肿瘤的积分 1 2 按积分高低分 为 0 分为一 1 3 分为 4 6 分为 1 4 统计学方法采用X 2 检验 2 结果 P T C 中p 5 3 基因的阳性表达率为7 1 7 9 明 显高于甲状腺瘤中的4 0 0 0 P 0 0 0 5 p 1 6 基 因在P T C 中的刚性表达率为3 5 0 3 明显低于甲 状腺瘤中的6 6 6 7 P 0 0 0 5 见图1 2 及表 1 发生颈部淋巴结转移的乳头状癌中p 5 3 基因的 阳性表达率为8 0 0 0 高于未发生转移的乳头状 癌的6 4 6 3 P 0 0 5 p 5 3 基因在甲状腺乳头状 癌l 级 级 级中的阳性表达率分别为5 7 1 4 7 0 1 5 和8 7 5 0 随着病理分级的增高而显著增 高 P 0 0 1 未发牛颈部淋巴结转移乳头状癌的 p 1 6 基因阳性表达率为4 5 1 2 明显高于发生颈部 淋巴结转移乳头状癌的2 4 0 0 P 0 0 1 p 1 6 基 因在甲状腺乳头状癌I 级 级 级中的阳性表达 率分别为5 0 0 0 3 7 3 1 和1 8 7 5 p 1 6 基因的 阳性表达率随着病理分级的增高而显著降低 P 0 0 1 见表2 3 讨论 p 5 3 基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的 基因 它是一种抑癌基因 位于染色体1 7 q 3 1 编码 条由3 9 3 个氨基酸组成的控制细胞增殖的核磷酸 图1p 5 3 基因在P T C 中的阳性表达 S P 法x 4 0 0 图2p 1 6 基因在P T C 中的阳性表达 S P 法x 4 0 0 表l甲状腺肿瘤中p 5 3 及p 1 6 基因表达结果比较 r t 阳 性率 表2P T C 病理分级和转移与p 5 3 及p 1 6 基因表达的关系 凡 阳性率 万方数据 蛋白 野生型p 5 3 在细胞G 期监控细胞D N A 损伤 维持细胞正常生长 抑制细胞恶性增殖 野生型 p 5 3 基因产物p 5 3 半衰期很短 因此在细胞中含量 很低 一般的免疫组化方法检测不出 而p 5 3 基因 突变后表达的突变型p 5 3 的半衰期大大延长 并积 聚于细胞核内 这也是应用免疫组化方法测定突变 型p 5 3 基因的基础 p 5 3 基因突变主要表现为点突 变 插入和纯合缺失 这些基因突变主要位于第5 号 至第8 号外显子 且9 5 以上为点突变 伴随基因 突变而来的是p 5 3 肿瘤抑制功能的丧失和致癌功能 的获得 许多研究表明 在人类乳腺癌 肺癌 肝癌 卵巢癌 膀胱癌等恶性肿瘤中具有较高的p 5 3 基因 的突变 J 与其表达率相一致 P e s t e r e l i 等旧1 认为 p 5 3 基因突变可能引起甲状腺癌变 是使其向低分 化甲状腺癌转化的重要原因 伴有p 5 3 突变的P T C 的恶性程度常偏高 在与P T C 关系的研究中 N i k i f o m v 1 认为突变型p 5 3 基因在早期P T C 组织或 分化较好的P T C 中表达较低 而在低分化和未分化 癌中呈高表达 在浸润 转移的P T C 组织中阳性表 达率也较高 本研究结果显示 p 5 3 在P T C 及甲状 腺瘤组织中的阳性表达率分别为7 1 7 9 和 4 0 0 0 p 5 3 在P T C 组织中的阳性表达率明显高于 在甲状腺瘤中的阳性表达率 P 0 0 0 5 提示突变 型p 5 3 基因在P T C 的发生中发挥重要作用 在P T C 中 p 5 3 在发生颈部淋巴结转移的乳头状癌中阳性 表达率高于未发生转移的乳头状癌 P 0 0 5 而 且p 5 3 的阳性表达率随着病理分级的增高而显著增 高 P 0 0 1 提示p 5 3 基因的突变促进了P T C 的 发生 发展及其转移 故对临床上评估P T C 的恶性 程度具有重要临床意义 p 1 6 基因是一种抑癌基因 又称多肿瘤抑制因 子 是1 9 9 3 年发现的继p 5 3 抑癌基因之后的又一引 人注目的新型抑癌基因 p 1 6 是细胞周期素依赖性 激酶 C D K 的抑制剂 可特异性与C D K 4 6 结合 主 要作用于G s 期转换过程 p 1 6 可和C y c l i n D l 竞 争性与C D K 4 6 结合 抑制C D K 4 6 对p R b 的磷酸 化激酶活性 而使p R b 处于非磷酸化或低磷酸化状 态 从而抑制转录因子E 2 F s 的活性 抑制细胞分裂 使细胞的增长分化协调进行 相反 C y c l i n D l 与 C D K 4 6 的结合占优势 过度刺激细胞分裂 使细胞 8 7 3 呈失控性生长而形成肿瘤1 4 jp 1 6 基因的失活在人 类多种肿瘤中广泛存在 主要表现为缺失 突变 5 C p G 岛甲基化 R N A 剪接加工错误等 其中p 1 6 基因甲基化是P T C 中常见的分子生物学事件 可能 是甲状腺组织发生癌变的重要原因 并且甲基化可 能是一个独立的因素 参与P T C 的浸润及转移pJ 本研究结果显示 p 1 6 在P T C 及甲状腺瘤的阳性表 达率分别为3 5 0 3 和6 6 6 7 p 1 6 在甲状腺瘤中 的阳性表达率明显高于在P T C 中的阳性表达率 P 0 0 0 5 说明p 1 6 表达的缺失导致C D K 活性 增强 促进细胞增殖 破坏甲状腺细胞正常周期的调 节 参与甲状腺癌的发生 在P T C 中 p 1 6 在发生转 移的乳头状癌中阳性表达率与未发生转移的乳头状 癌的阳性表达率差异有统计学意义 P 0 0 1 发 生转移的乳头状癌p 1 6 阳性表达率明湿低于未发生 转移的乳头状癌 与B o h z e 等 1 的研究结果相符合 提示p 1 6 的表达缺失与P T C 的转移相关 p 1 6 基因 的阳性表达率随着病理分级的增高而显著降低 P 0 0 1 提示p 1 6 基因的失表达与恶性肿瘤的 分化程度相关 即甲状腺癌组织恶性度越高 p 1 6 的 失表达越显著 所以p 1 6 基因的失表达可能在P T C 的中 晚期发挥重要作用 参考 文献 1 S i g n o r e t t iS M u s h yM c g iM G e la D e t e c t i o no fc l o n a lT c e l l r e c e p t o r1 e n er e a r r a n g e m e n t s i np a l l i a e m b e d d e dt i s s u eb y p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o na n dn o n r a d i o a c t i v e s i n g l e s t r a n d c o n f o r m a t i o n a lp o l y m o r p h i s ma n a l y s i s J A mJP a t h o l 1 9 9 9 1 5 4 1 6 7 7 5 E 23 P e s t e r e f iH E O 誊1 1 8M O r e nN 耐a B c l 2a n d0 5 3e x p r e s s i o ni n i n s u l a ra n di nw e l l d i f f e r e n t i a t e dt h y r o i dc a r c i n o m a sw i t ha l li n s u l a r p a t t e r n J E n d o c rP a t h o l 2 0 0 1