滤纸干血-新生儿促甲状腺素酶联免疫分析试剂盒的研制.pdf

收稿日期 2003203225 修回日期 2003204210 作者简介 官国英 1969 女 汉族 四川威远人 工程师 放射化学专业 第16卷 第2期 2003年5月 同 位 素 Journal of Isotopes Vol 16 No 2 M ay 2003 滤纸干血 新生儿促甲状腺 素酶联免疫分析试剂盒的研制 官国英1 王晶晶1 韩世泉1 于 洁1 王玉肖1 刘一兵1 李丽波1 陈志东2 张彬彬2 傅宝国2 1 中国原子能科学研究院同位素研究所 北京 102413 2 辽宁省黑山县地方病防治所 辽宁 黑山 121400 摘要 以辣根过氧化物酶标记链亲合素 SA 两株识别人促甲状腺素 hTSH 高度特异的单克隆抗体分别用 于包被微孔和生物素化 以四甲基联苯胺 TMB 为底物 建立了滤纸干血2新生儿促甲状腺素生物素2亲合素 酶联免疫分析 N eonatal TSH2BA2EL ISA 试剂盒的制备方法 本方法的灵敏度为0 5 m I U L 批内变异系 数 15 批间变异系数 20 回收率为90 1 103 3 本方法所制备的试剂盒与N eonatal TSH2IR2 MA 磁颗粒法 试剂盒具有良好的相关性 相关方程为y 1 01x 0 34 相关系数为r 0 873 本试剂盒无 放射性 操作简便 快速 适用于临床检测和科研应用 关键词 生物素2亲合素系统 BA S 酶联免疫分析 EL ISA 滤纸干血2新生儿促甲状腺素 N eonatal TSH 中图分类号 R446161 文献标识码 A 文章编号 100027512 2003 0220092204 血清TSH水平是诊断原发性甲状腺机能减 退的可靠 灵敏 特异性指标 纸片法TSH主要 用于新生儿 N eonatal 先天性甲状腺机能减退 的筛选 先天性甲状腺机能减退是造成低智儿的 重要原因之一 居先天性代谢病发病率之首 1 用TSH进行早期诊断 在小儿未发生临床症状 之前 就予以足量的甲状腺制剂或合成的甲状腺 素片进行替代治疗 即可完全阻断小儿生长发育 障碍和不可逆智力低下 另外 在缺碘地区开展 新生儿筛查能够直接反应该地区碘缺乏的程度 以及碘缺乏病的消长趋势 是监测碘缺乏病的一 个特异性指标 微量TSH测定是判断下丘脑2垂体2甲状腺 轴相互关系和正确评价他们功能状态的指标之 一 尤其是对先天性甲状腺功能减退的诊断具有 独特意义 并对临床治疗具有指导作用 1 目前 用血滴纸片法检测新生儿脐带血或足跟血最常 用的方法是免疫放射测定法 IRMA 但该法具 有放射性 标记物放射性半衰期较短 且对检测 仪器要求较高 本工作拟建立一种非放射性检测 系统 生物素2亲合素酶联免疫分析 BA S2 EL ISA 以克服IRMA的不足之处 1 材料和方法 111 试剂和仪器 包被用抗TSH单克隆抗体 中国原子能科 学研究院同位素研究所生产 生物素化抗TSH 单克隆抗体 购自芬兰 TSH抗原 生物素化试 剂 四甲基联苯胺 TMB 脲素过氧化氢 链亲 合素化酶 均为美国Sigma公司产品 96孔酶标 板为美国Cost公司产品 Spectra酶标仪 奥地 利SL T公司产品 N eonatalTSH2IRMA 磁颗粒 法 试剂盒 中国原子能科学研究院同位素研究 所产品 临床样品 滤纸干血纸片 脐带血 辽宁 省黑山县地方病防治所提供 1 2 实验方法 1 2 1 抗TSH单克隆抗体的生物素化 2 3 将 已纯化好的抗TSH单克隆抗体 M cA b 用0 1 mol L的N aHCO3配成TSH浓度为1 g L的 溶液 在1 mL抗体溶液中加入20 L溶于二甲 基甲酰胺浓度为20 g L的生物素2N2羟基丁二 酰亚胺酯 BNHS 溶液 混匀 室温反应1 0 h 于4 用0 05 mol L pH 7 2的磷酸盐缓冲 液 PBS 透析过夜 然后加入等体积甘油 20 贮存备用 1 2 2 固相抗体的制备 向聚苯乙烯微量滴定 板孔中加入含有TSH包被单克隆抗体的pH 9 6的碳酸盐缓冲液 每孔100 L 置4 冰箱 内过夜后37 封闭2 h 此酶标板即可用于免疫 反应 1 2 3 TSH标准品的制备 将TSH抗原标定 后与洗好的血球以体积比1 1混匀 32 L 点 制成0 5 10 20 40 80 160 m I U L的系列全血 纸片标准品 晾干 4 贮存备用 1 2 4 底物溶液和中止剂 将TMB和H2O2 分别溶于pH 5 0醋酸2磷酸盐缓冲液中 使其 浓度分别为0 6 1 2 mmol L 使用时以体积比 1 1混合即为底物溶液 中止剂为2 mol L的 H2SO4溶液 1 2 5 N eonatal TSH2BA2EL ISA分析程序 用洗涤液 含0 05 Tw een220 250 L 孔 将微 量滴定板预洗3次 3 mm纸片1枚 标准品或 样品 和100 L生物素化抗体加入预先洗好的 包被有TSH单克隆抗体的微量滴定板中 混匀 4 温育过夜 第一步 弃反应液 用洗涤液洗 板5次 加入链亲合素化酶工作液100 L 孔 37 温育0 5 h 第二步 弃反应液 用洗涤液 洗板5次 加入底物液100 L 孔 避光显色15 m in 以 2mol L的H2SO4溶液50 L 孔中止显 色 于450 nm处测定其光密度OD 绘制标准曲 线 计算样品中TSH含量 1 3 方法学比较 用本试剂盒与N eonatal TSH2IRMA 磁颗 粒法 试剂盒检测同一批样品 n 37 比较其相 关性 2 结果与分析 2 1 抗体包被浓度的选择 用pH 9 6的N a2CO32N aHCO3缓冲液将 TSH包被抗体配制成0 5 0 8 1 0 1 2 1 6 2 0 2 5 3 3 5 0 1010mg L工作液包被微孔 结果示于图1 由图1可知 包被浓度为2 0mg L即可达到要求 2 2 Neonatal TSH BA EL ISA和Neonatal TSH EL ISA的比较 采用N eonatal TSH2BA2EL ISA与HRPO 标记TSH抗体即N eonatal TSH2EL ISA两种实 验方案的标准曲线示于图2 图2显示N eonatal TSH2BA2EL ISA系 统 灵 敏 度 高 于N eonatal TSH2EL ISA 更适合用作滤纸干血2新生儿促甲 状腺素酶联免疫分析 图1 抗体包被浓度 1 TSH含量为0 2 TSH含量为5 m I U L 3 TSH含量为160 m I U L 图2 Neonatal TSH BA EL ISA与 Neonatal TSH EL ISA比较 1 TSH2EL ISA标准曲线 2 TSH2BA2EL ISA标准曲线 39 第2期 官国英等 滤纸干血2新生儿促甲状腺素酶联免疫分析试剂盒的研制 2 3 加样量对Neonatal TSH BA EL ISA的影 响 2 3 1 加入血样纸片量对N eonatal TSH2BA2 EL ISA的影响 用 3 mm打孔钳向每孔中打 入纸片1枚或2枚 结果示于图3 图3显示加 入1枚纸片与2枚纸片 结果无明显区别 且其 结果均能满足工作需要 因此为节约成本 减少 工作量 在分析中选用1枚纸片 2 3 2 加样量对N eonatal TSH2BA2EL ISA的 影响 每孔分别加入100 200 L工作液 结果 示于图4 图4显示加入100或200 L工作液 其结果均能满足要求 且其结果基本一致 因此 分析过程中选用工作液为100 L 2 4 Neonatal TSH BA EL ISA反应动力学 1 第一步于37 分别温育3 4 5 6 h 第 二步于37 温育0 5 h 结果显示非特异太高 灵敏度不能满足要求 2 第一步于4 分别温育16 18 20 24 h 第二步于37 温育0 5 h 结果示于图5 图5 显示4 温育过夜 16 h 对测量结果无明显 影响 2 5 Neonatal TSH BA EL ISA方法学鉴定 2 5 1 N eonatal TSH2BA2EL ISA的标准曲线 与灵敏度 TSH2BA2EL ISA标准曲线示于图 6 同时测定20个零标准的OD450 以x 2s 计算 其分析灵敏度为0 5 m I U L 2 5 2精密度 重复测定三份含有不同TSH浓 度的血片样品 观察批内批间变异 结果列于表 1 由表1可知 试剂盒的批内变异 15 批间 变异 20 符合免疫分析要求 2 5 3 N eonatal TSH2BA2EL ISA回收率 取 三份不同TSH浓度的血片样品 测定TSH回收 率 结果列于表2 由表2可知 回收率为90 1 103 3 符合免疫分析要求 图3 加入纸片量对Neonatal TSH BA EL ISA的影响 1 加入1枚纸片 2 加入2枚纸片 图4 加样量对Neonatal TSH BA EL ISA的影响 1 100 L工作液 2 200 L工作液 图5 Neonatal TSH BA EL ISA 第一步4 反应动力学 1 TSH含量为0 2 TSH含量为5 m I U L 3 TSH含量为160 m I U L 图6 Neonatal TSH BA EL ISA标准曲线 49同 位 素 第16卷 表1 Neonatal TSH BA EL ISA试剂盒的批内批间变异 样 品 批内 n 8 x m I U L 1 s m I U L 1 CV 批间 n 15 x m I U L 1 s m I U L 1 CV 17 20 710 46 80 811 7 229 93 812 729 45 41814 349135 911 956147 212 7 表2 Neonatal TSH BA EL ISA回收实验结果 TSH含量预期值 m I U L 1 TSH含量测定值 m I U L 1 回收率 7 16 490 1 29 630 2102 1 57 159 0103 3 2 6 本试剂盒与Neonatal TSH IRMA 磁颗粒 法 的比较 用两试剂盒同时测定37份纸片样品 并对 其结果进行相关性分析 其相关方程为y 1 01 x 0 34 相关系数r 0 873 表明两种试剂盒具 有良好的相关性 3 结 论 本试剂盒引入生物素2亲合素系统 通过对 抗体包被浓度 免疫分析方法 加样量 免疫反应 时间等条件的优化 使本试剂盒达到临床检测及 科研应用要求 本试剂盒无放射性 不会造成环 境污染 操作简便 快速 尤其适用于临床大批量 新生儿筛查 参考文献 1 蔡锡麟 陈耀华 秦明秀 1 临床放射免疫学 M 北 京 原子能出版社 19941133 1411 2 D iamandis EP Christopouls TK TheBiotin2 Str2 ept A vidin System Principles and Applications in Biotechnology J Clin Chem 1991 37 625 636 3 官国英 韩世泉 王玉肖 等 1 高灵敏度人促甲状腺 激素 hTSH 酶联免疫分析试剂盒 J 原子能科 学技术 2002 36 2 129 133 The Establishment of an Enzyme L inked I mmunosorbent Assay for Neonatal Thyrotropin GUAN Guo2ying 1 WAN G Jing2jing1 HAN Shi2quan1 YU Jie1 WAN G Yu2xiao1 L I U Yi2bing 1 L IL i2bo1 CHEN Zhi2dong2 ZHAN G Bin2bin2 FU Bao2guo2 1 D epartm ent ofIsotope China Institute of A tom ic Energy B eijing102413 China 2 Institute of P rophy lax is and T reatm ent f or Endem ic D isease H eishan121400 China Abstract A sensitive and specific EL ISA for neonatal thyrotropin N eonatal TSH is established by using two anti2TSH monoclonal antibodies One of them is coated on the m icrotiter plate and the other is biotinlated The label is horseradish peroxidase HRP conjugate of streptavidin TMB2 H2O2solution is used as the substrate of HRP The sensitivity of the assay is 0 5 m I U L The in2 tra2and intro2assay CV s of 3 samples are low er than 15 and 20 respectively The analytical re2 covery is in the range from 90 1 to 103 3 Compared w ith IRMA the correlative equation isy 1 01x 0 34 andr 0 873 This