第四节 单链丝状噬菌体载体.doc

第四节 单链丝状噬菌体载体一、M13 噬菌体的生物学1M13 噬菌体的组成和结构M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成 （GenBank 注册号为 V00604） 。基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因 和基因 以及基因 和基因 之间，其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质，包括复制蛋白（基因 ， 和 ），形态发生蛋白（基因， 和 ），结构蛋白（基因 、 和 ）。所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中。基因组 DNA 为正链，按基因 至基因 方向合成，与噬菌体的 mRNA 序列同义。图 3-20 是 M13 噬菌体的遗传图谱。M13 噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长 880nm ，直径 6-7nm 。噬菌体颗粒的核心由 2700 个基因 编码的结构蛋白呈管状排列而成（图 5-32），成熟的基因 的产物为由 50 个氨基酸残基组成的 螺旋蛋白。顶端由 5 个基因 和 5 个基因 产物组成，作用于间隔区中的包装信号。 5 个基因 蛋白和 5 个基因 蛋白位于丝杆的末端，参与对性纤毛的吸咐。图 3-21 是 M13 噬菌体结构模型。2M13 噬菌体的增殖吸附是噬菌体感染的第一步， M13 噬菌体只感染具有性纤毛的菌株，携带 F 质粒的菌株可产生性纤毛。在吸附过程中，噬菌体的基因 蛋白与性纤毛发生作用。随后丝状噬菌体穿入到性纤毛，基因 蛋白与宿主的 TolQ 、TolR 和 TolA 蛋白发生作用，去除外壳蛋白，致使病毒 DNA 及附着于其上的基因 蛋白进入宿主菌体内。在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA （正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链 DNA ，用于 DNA 的复制，因此这种双链 DNA 称为复制型 DNA （replicative form DNA） ，即 RF DNA 。通过 复制方式， RF DNA 进行扩增，基因的转录也随即开始。基因组中的任意一个启动子都可以启动基因的转录，单方向地终止于下游的终止子。启动子和终止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频繁。 M13 噬菌体在感染细胞中的复制见图 3-22 。当基因 蛋白在亲代 RF DNA 的正链特定位点上产生一个切口时，便启动噬菌体基因组进行滚环复制。此时，在大肠杆菌的 DNA 聚合酶 的作用下，以负链为模板在切口的 3 末端加入核苷酸，并持续 DNA 的合成，用新合成的 DNA 替换原有的正链。当复制叉环绕模板整整一周时，被取代的正链由基因 产物切去，经环化后形成单位长度的噬菌体基因组 DNA 。在感染开始的 1520 分钟内，这些子代正链在宿主细胞酶的作用下，又转变成 RF DNA ，然后以之为模板继续转录并继续合成子代正链 DNA 。当感染细胞内累计有 100-200 个 RF DNA 时，细胞内也产生了足够的单链 DNA 结合蛋白，即基因 蛋白。该蛋白可以抑制翻译活性，特别是抑制基因 mRNA 的翻译，并且强烈地结合在新合成的正链 DNA 上，阻止其转化成 RF DNA 。此时， DNA 的合成几乎只产生子代正链 DNA 。另外，基因 蛋白和基因 蛋白也是噬菌体特异 DNA 合成的强力抑制子，从而限制感染细胞内 RF DNA 的数量。结果，感染细胞内 RF DNA 的数目和子代正链 DNA 的产生速率都能保持适度。成熟噬菌体颗粒由 11 个病毒蛋白中的 5 个组成，至少 4 个其他蛋白（如基因 、 和 蛋白，以及宿主的硫氧还蛋白（thioredoxin）对噬菌体颗粒的组装和分泌是必须的。 二、M13 噬菌体载体 单链 DNA 的酶切和连接是比较困难的，因此 M13 噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的 RF DNA。RF DNA 很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。1载体的插入位点在 M13 噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源 DNA（基因 / 和基因 / 之间） 。基因 和基因 之间的 508bp 间隔区是主要的外源片段插入位点。在基因 和基因 之间的小间隔区也可用来插入外源片段，但是在操作过程中，需要获得感染细胞的菌落进行影印筛选，比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦。基因 也可用来克隆外源片段。2M13 噬菌体载体组成现在所使用的 M13 噬菌体载体是 Messing 及其同事建立的 mp 系列载体，以基因 和基因 之间的区域作为外源 DNA 插入区。mp 载体系列都是从同一个重组 M13 噬菌体 （M13mpl） 改造而来的。在 M13mpl 载体中，间隔区内的 Hae 位点插入了一小段大肠杆菌 DNA ，引入 互补筛选。3M13mpl8 和 M13mpl9M13mpl8 和 M13mpl9 这两个载体含有 13 个不同的酶切位点，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段（图 3-23）。 M13mpl8 和 M13mpl9 DNA 的全序列已经测定完成 （GenBank 注册号为 M77815 和 L08821） ，这两种载体只是在 lacZ 区内不对称的多克隆区的方向上有所不同。当 RF DNA 被两种不同的限制酶切割以后， M13mpl8 和 M13mpl9 轻易不能重新环化。仅当连接混合液中含有带匹配末端的外源双链 DNA片段时，方可闭合成环。这一片段在 M13mpl8 和 M13mpl9 中将以两个互为相反的方向插入。这样一来，在 M13mpl8 的正链中含有外源 DNA 双链的其中一条链，而在 M13mpl9 正链中则含有外源 DNA 的另一条链，即 M13mpl8 重组体的子代噬菌体内含有外源 DNA 的一条链， M13mpl9 重组体的子代噬菌体内则含有它的互补链。故用 M13mpl8 和 M13mpl9 作为一对载体，就可能用一个引物 （通用引物） ，从所插入 DNA 片段的任一端开始，测定互为相反的两条链的 DNA 序列，并可制备只与外源 DNA 的任意一条链互补的 DNA 探针。三、 M13 噬菌体载体的宿主菌 由于 M13 噬菌体通过 F 质粒编码的性纤毛进入宿主细胞内，故只能用雄性细菌来增殖病毒。 Messing 及其同事已经构建了许多携带 F 质粒并便于 M13 载体进行基因操作的多种大肠杆菌菌株，其中最重要的遗传标志有：（1） lacZ D Ml5 lacZ 基因缺失突变体。（2） D（lac-proAB）lac 基因缺失突变体。（3） lacIq lacI 基因的突变体。（4） proAB 细菌染色体上脯氨酸生物合成酶类的编码区域。（5） traD36 抑制 F 因子接合转移的突变。（6） hsdRl7 与 hsdR 4 对大肠杆菌 K 株 类限制 - 修饰系统失去限制活性但仍保留修饰功能的突变体。（7） recA1 大肠杆菌重组酶基因。（8） supE 琥珀抑制基因。在 M13 噬菌体载体中进行克隆时常用的宿主菌株如下。JM101 supE D （lac-proAB）FtraD 36 proAB + lac I q lacZ D M15JM105 JM101/ hsdR 4JM107 JM101/ hsdR 17JM109 JM101/ hsdR 17 recA1TG1 JM101/ hsd D5（不修饰不限制）XL1-Blue supE lac- hsdR 17 recA1 F proAB + lac I q lacZ D M15Tn 10 （Tet r） 四、丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题 在丝状噬菌体载体的克隆中经常遇到两类问题。（1）外源 DNA 区段的部分缺失（2）外源 DNA 总是以单方向插入五、噬菌粒 噬菌粒（phagemid）实际上是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有 ColE1 复制起点及抗生素抗性选择标记的质粒，以及丝状体噬菌体的间隔区。此间隔区含噬菌体 DNA 合成的起始与终止及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用序列。含噬菌粒的细菌被噬菌体感染后，基因 蛋白可作用于噬菌粒的间隔区，启动滚环复制产生 ssDNA 并进行包装。克隆于这些载体内的外源 DNA 区段可以象质粒一样用常规方法进行增殖。而带有这种质粒的细菌被 M13（或 f1） 丝状噬菌体感染后，在病毒的基因 蛋白影响下，质粒的复制方式发生改变。基因 产物与质粒所携带的基因间隔区相互作用，启动滚环复制，产生质粒 DNA 一条链的拷贝，最终包装在子代噬菌体颗粒中。pUC118 和 pUC119 是功能比较完善的噬菌粒载体，对外源 DNA 片段的大小不那么敏感，并且保留了 pUC 质粒在克隆操作方面的优点（图 3-24）。在 pUC18/19 中增加了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列（IG），当含这些质粒的细胞被适当的 M13 丝状噬菌体感染时，可合成质粒 DNA 的其中一条链，并包装在子代噬菌体颗粒中。通过纯化噬菌体颗粒，可制备单链 DNA ，用于 DNA 序列测定、定点诱变或制备探针。噬菌粒具有以下特征： 双链 DNA 既稳定，又高产，具有常规质粒的特征； 免却了将外源 DNA 片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一既繁琐又费时的步骤； 由于载体足够小，故可得到长达 10kb 的外源 DNA 区段的单链。噬菌粒的主要优点在于它可以产生大段外源 DNA 的适量单链拷贝，又不必担心发生缺失突变，而这些外源 DNA 区段常常由于太大而不能克隆于常规 M13 载体。但许多噬菌粒都有一个主要缺点，即辅助噬菌体感染后，有时候单链 DNA 的产量较低且重复性较差。六、M13KO7 辅助噬菌体 M13KO7 辅助噬菌体是 M13 的衍生株，大小为 8.7kb ，其结构组成见下图。 M13KO7 噬菌体带有来自 p15A 质粒的复制起点，因此可以象质粒一样复制，且可以与带 ColE1 的质粒共存于同一个宿主菌中。还带有一个来自转座子 Tn903 的卡那霉素抗性基因（kanr），用作选择标记。基因 带有一个 G 至 T 的突变（第 6125 核苷酸），导致基因 蛋白第 40 位氨基酸由甲硫氨酸变为异亮氨酸。辅助噬菌体 M13KO7 的遗传图谱见图 3-25 。当 M13KO7 感染带有噬菌粒的大肠杆菌后，如 E.coli（pUC118），进入宿主细胞内的单链 DNA ，在宿主胞内酶的作用下转变为双链形式，后者可在质粒 p15A 的复制起点控制下进行复制。由于细胞内 M13K07 双链 DNA 的积累并不需要病毒基因产物，细胞内的噬菌粒几乎没有机会干扰所进入的 M13K07 病毒基因组的早期复制。M13KO7 基因组双链 DNA 可表达产生子代单链 DNA 所必需的所