玉米不同组织器官谷氨酰胺合成酶同工酶表达差异及聚合方式

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2017 43 9 1410 1414 http zwxb chinacrops org ISSN 0496 3490 CODEN TSHPA9 E mail xbzw 本研究由国家重点研发计划项目 2016YFD0300205 和小麦玉米作物学国家重点实验室 39990047 资助 The study was supported by the National Key Research and Development Program of China 2016YFD0300205 and State Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science 39990047 通讯作者 Corresponding author 马新明 E mail xinmingma Tel第一作者联系方式 E mail xiaochun w TelReceived 收稿日期 2016 12 21 Accepted 接受日期 2017 04 20 Published online 网络出版日期 2017 05 08 URL DOI 10 3724 SP J 1006 2017 01410 玉米不同组织器官谷氨酰胺合成酶同工酶表达差异及聚合方式 王小纯 1 2 3 张浩然3 韦一昊1 贾喜婷3 谷明鑫3 马新明1 1河南农业大学河南粮食作物协同创新中心 河南郑州 450002 2河南农业大学省部共建小麦玉米作物学国家重点实验室 河南郑州 450002 3河南农业大学生命科学学院生物化学系 河南郑州 450002 摘 要 谷氨酰胺合成酶 GS 是作物氮同化及转移利用的关键酶 本试验研究了玉米灌浆期不同组织器官的 GS 同工酶 表达特性 鉴定了玉米 GS 同工酶的聚合方式 Western blot 结果表明 玉米不同组织器官的 GS 同工酶亚基表达存在明 显差异 分子量约 40 kD 的 GS1 亚基在所有组织中均大量表达 39 kD 的 GS1 亚基仅在穗位节及穗柄中大量表达 分子 量约 44 kD 的 GS2 亚基在叶片等光合组织中微量表达 通过改进 BNE 技术 结合胶内转移酶活性的测定 分析了玉米 GS 同工酶全酶的大小 利用 2 D 胶结合 Western blot 鉴定了 GS 同工酶相应的亚基组成 结果表明 在玉米组织鉴定出 3 种分子量不同的 GS 同工酶 GS2 全酶分子量约 460 kD 为十聚体 GS1 全酶有 2 种聚合状态 一种是分子量约 410 kD 的十聚体 另一种是分子量约 240 kD 的五聚体形式 可见玉米 GS 同工酶表达存在多种方式 关键词 玉米 谷氨酰胺合成酶 GS 表达 BNE 聚合方式 Differential Expression and Assembly Mode of Glutamine Synthetase Isoen zymes in Different Tissues and Organs of Maize WANG Xiao Chun1 2 3 ZHANG Hao Ran3 WEI Yi Hao1 JIA Xi Ting3 GU Ming Xin3 and MA Xin Ming1 1 Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops Henan Agricultural University Zhengzhou 450002 China 2 State Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science in China Henan Agricultural University Zhengzhou 450002 China 3 Department of Biochemistry College of Life Science Henan Agricultural University Zhengzhou 450002 China Abstract Glutamine synthetase GS is a key enzyme in nitrogen assimilation and recycling in cereals In this study the expres sion characteristics of GS isoenzymes in different tissues and organs of maize in grain filling period were analyzed and the as sembly of GS isoenzymes were indentified The GS isoforms expressed differentially in different organs were shown by West ern blot obviously GS1 with a molecular weight of about 40 kD expressed highly in all tissues and GS1 with a molecular weight of about 39 kD was merely expressed in the node of ear position and pedical and GS2 with a molecular weight of about 44 kD was weakly expressed in the photosynthtic tissue such as leaf With a modified blue naive PAGE BNE technique and in gel ac tivity analysis the size of GS holoenzyme was calibrated combined the 2 D gel with western blot analysis the subunits composi tion of GS isoenzymes were identified Three GS isoenzymes with different sizes were identified in maize GS2 holoenzyme was about 460 kD and likely a decamer GS1 holoenzyme existed two kinds of assembly state one was about 410 kD and likely a decamer another was about 240 kD and more likely a pentamer therefore the expression of GS isoenzymes exists diversity in maize Keywords Maize Glutamine synthetase GS Expression Blue native PAGE BNE Assembly 氮是玉米生长发育必须的大量矿质营养元素 也是 玉米产量的一个主要限制因素 在高等植物中 谷氨酰胺 合成酶 GS 谷氨酸合酶 GOGAT 循环是氮素同化的主要 途径 是无机氮转化为有机氮的枢纽 1 GS是 GS GOGAT 循环中的关键酶 因此 GS 同工酶表达成为提高作物氮 素利用率的一个研究热点 高等植物中有 2 种 GS 同工酶 定位于细胞液的 GS1 和质体的 GS2 研究表明 GS 同工酶的表达受组织器官 第9期 王小纯等 玉米不同组织器官谷氨酰胺合成酶同工酶表达差异及聚合方式 1411 生长发育 新陈代谢及环境因素等的调控 2 4 GS1 主要 参与蛋白质等含氮有机化合物降解产生氨的再同化及转 移利用 1 GS2 主要参与光呼吸和硝酸盐还原产生的氨的 同化 5 高等植物 GS2 亚基较大 42 45 kD 由单一核基 因编码 而 GS1 亚基较小 38 40 kD 由 2 5 个核基因编 码 6 12 玉米 GS2 亚基约 44 kD 由单一核基因编码 GS1 亚基 39 40 kD 由 5 个核基因编码 13 植物 GS 必须组装成聚合体才具有催化活性 早期电 子显微镜研究表明大豆GS1全酶是八聚体 由2个平面环 组成 每个平面环由 4 个亚基组成 14 Llorca 等 10 利用 X ray 晶体技术研究菜豆重组 GS1 结构 发现其与大豆 GS1 全酶结构相同 即由两个 4元环聚合体组成的八聚体 用分析离心机测定菜豆 GS1 全酶相对分子质量为 344 kD 与晶体研究结果一致 X ray 晶体分析表明玉米 GS1 苜 蓿 GS1 全酶是由 2 个五元环聚合体组成的十聚体 15 17 但没有关于 GS2 全酶结构的报道 利用凝胶过滤及分析离心机测定纯化 GS 全酶的分子 量 也可以初步判断 GS 的聚合状态 但是所用材料多 费时长 仪器设备昂贵 而且分辨率低 近年来 Blue native PAGE BNE 快速发展 18 19 利用凝胶电泳对蛋白 质复合体依据其大小进行分离 具有样品需求少 分辨率 高 简便快捷且保持蛋白质聚合状态等特点 越来越多地 应用于活性蛋白的低聚物状态研究 20 22 本研究通过改良 BNE 结合蛋白质免疫印迹等技术 分析了玉米不同组织 部位 GS 的表达特性 并快速鉴定了 GS 同工酶的聚合状 态 与玉米GS1晶体研究结果一致 为简便快捷及时研究 GS 同工酶表达调控方式及其与玉米氮素利用的关系提供 了技术保障 1 材料与方法 1 1 材料 将玉米品种豫单 916 种植于河南农业大学农场 郑州 常规田间管理 于灌浆期选取根 地下节根和地上气生根 及不同叶位的叶片 叶脉 叶鞘 节 节间 穗柄 苞叶和 籽粒 快速清洗 剪碎 于液氮中速冻 置 80 保存备用 1 2 粗酶液的制备 称取 0 5 g 不同组织部位的样品 加液氮研磨 再加 3 倍体积的提取缓冲液 100 mmol L 1 Tris HCl pH 7 6 1 mmol L 1 EDTA 1 mmol L 1 MgCl2和 10 mmol L 1 巯基 乙醇 13 22 混成匀浆 冰浴静置 30 min 后 4 13 000 g 离心 30 min 上清液即粗酶提取液 1 3 电泳分离鉴定 GS 同工酶 利用 3 种凝胶电泳系统分离鉴定 GS 同工酶 1 3 1 不连续活性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统 Native PAGE 由 3 的浓缩胶 pH 6 7 和 5 的分离胶 pH 8 7 组成 用于玉米不同组织器官的蛋白提取液中 GS 同工酶 亚型的分离和酶活性检测 22 4 预冷电极缓冲液 25 mmol L 1 Tris 192 mmol L 1甘氨酸 粗酶液与 5 上样缓 冲液 25 mmol L 1 Tris HCl pH 7 6 5 w v 巯基乙醇 0 05 w v 溴酚蓝 50 v v 甘油 混匀后上样 于 4 C 条 件下电泳 浓缩胶稳压 80V 分离胶稳压 120 V 1 3 2 Blue native PAGE BNE 依据 Wittig 等 18 改良 BNE 电泳方案 根据 GS 同工酶全酶大小进行分离并鉴定 其相对分子质量 凝胶由 3 的浓缩胶和 4 13 的梯度 分离胶组成 样品处理同 Native PAGE 加入预冷阳极缓 冲液 25 mmol L 1咪唑 HCl pH 7 0 首先使用阴极电泳 缓冲液 A 0 02 Coomassie Blue G250 50 mmol L 1 Tricine HCl 5 mmol L 1咪唑 pH 7 0 于 4 C 100 V 电泳 20min 后 更换为阴极电泳缓冲液 B 50 mmol L 1 Tricine HCl 5 mmol L 1咪唑 pH 7 0 继续电泳至样品进 入 4 13 的梯度分离胶 然后进行稳流 15 mA 电泳至 蓝色指示剂出胶 22 1 3 3 Clear native PAGE CNE 参考 Wittig 等 19 凝 胶体系和 BNE 一样 但只使用阴极电泳缓冲液 B 于 100V 电泳至样品进入分离胶 然后进行稳流 15 mA 电泳 至蓝色指示剂出胶 胶内 GS 活性依据 Wang 等 22 方法检测 活性染色结 束后扫描结果 然后再用考马斯亮蓝 R250 染色 BNE 胶 中 以高分子蛋白 Marker Amersham HMW Calibration Kit For Native Electrophoresis 为标准 利用 Gel Pro ana lyzer 计算 GS 同工酶全酶的相对分子质量 1 4 Western blot 检测 GS 同工酶亚基 取适量粗酶提取液与等体积 2 的上样缓冲液 100 mmol L 1 Tris HCl pH 6 8 4 w v SDS 10 v v 巯 基乙醇 0 2 w v 溴酚蓝 20 v v 甘油 混合 沸水浴 5min 变性处理 室温条件下利用 SDS PAGE 5 浓缩胶 12 分离胶 分离蛋白质 将蛋白转移至 PVDF 膜上进行 Western blot 检测 使用本实验室制备的小麦 GS 多克隆 抗体检测玉米 GS亚基 使用 Bio Rad Clarity Western ECL 试剂盒显色 以蛋白 Marker Thermo Scientific PageRuler Prestained Protein Ladder 为标准 利用 Gel Pro analyzer 计算 GS 同工酶亚基分子质量 1 5 GS 同工酶亚基组成的鉴定 切取 BNE 胶条 浸泡于含 1 SDS 和 1 巯基乙醇 的变性液中 37 变性处理 2 h 18 然后用去离子水冲洗 凝胶 3 5 次 置 SDS PAGE 浓缩胶顶部 室温条件下电 泳 电泳结束后 将蛋白质转移至 PVDF 膜上进行 Western blot 分析 2 结果与分析 2 1 玉米 GS 同工酶表达特点 Western blot 结果显示玉米中有 3 种 GS 亚基 即 40 kD 和 39 kD 的胞液型 GS GS1 及 44 kD 的质体型 GS GS2 且不同组织器官中 GS 同工酶表达差异较大 图 1 A 40 kD 的 GS1 在玉米中起主导作用 不同组织器官 均有较大的表达量 籽粒除外 39 kD 的 GS1 仅在穗位节 1412 作 物 学 报 第 43 卷 图 1 玉米不同组织 GS 同工酶表达和活性分析 Fig 1 Analysis of the expression and activity of GS isoforms from different tissues of maize A Western blot 鉴定 GS 同工酶亚基的表达 12 SDS PAGE 分 离玉米蛋白 转膜后利用小麦 GS 多克隆抗体检测 GS 亚基 B 胶内 GS 酶活性检测 以 5 Native PAGE 分离组织蛋白 胶内 GS 酶活性分析检测 GS 同工酶活性 Roots 根 Lower 1th leaf 穗下第 1 叶 Sheath 穗位叶鞘 Ear leaf 穗位叶 Vein 穗位叶 叶脉 Internode 穗位节间 Node 穗位节 Pedicel 果穗柄 Husk leaves 苞叶 Grain 籽粒 Top leaf 顶部功能叶 A Expression of GS isoforms detected by Western blot Protein extracts separated by 12 SDS PAGE and then probed with GS ployclonal antibodies against wheat after electrobloting B In gel detection of GS activity Proteins from different tissues were sepa rated by 5 Native PAGE and GS isoforms were detected with the in gel GS activity analysis 间 节和果穗柄中表达 且后 2 个部位表达量较高 可能 与玉米灌浆期氮素营养的运输有关 GS2 只在功能叶的叶 片 叶脉中少量表达 可能与玉米是 C4植物 光呼吸强度 低有关 Native PAGE 结合胶内 GS 酶活性分析显示 图 1 B 玉米根系 叶片 茎节 穗柄等组织中均检测到 GS 活性带 叶片中最高 籽粒中最低 但叶片提取液中仅检 测到 1 条 GS 活性带 可能因 GS2 活性太低或不连续 Native PAGE 分离蛋白质的特点导致的 2 种 GS 同工酶没 有被分离开 此外与 Western blot 结果一致 在含两种 GS1 亚基的穗位节和果穗柄中检测到 2 个 GS 同工酶 2 2 玉米 GS 同工酶大小鉴定 通过改良 BNE 方法 在玉米叶片和穗位节间 节和 果穗柄中检测到 2 个大小不同的 GS 活性带 其他组织中 则只检测到一条 GS 带 图 2 A 其中 迁移率较大的 GS 同工酶全酶分子量约 240 kD 活性较低 迁移率较小的 GS 同工酶分子量约 410 kD 活性非常高 利用 BNE 分离 玉米叶片总蛋白后 进行 Western blot 检测到一个相对 分子质量约 460 kD 的 GS 同工酶 图 2 C 可能因其活性 低 且分子量接近 RuBP 羧化酶 其活性被羧化酶的蓝色 条带遮盖 22 2 3 GS 同工酶及聚合状态鉴定 第一相胶为 BNE 用以分离玉米组织蛋白复合体 切取相应组织的泳道进行蛋白质变性处理 第二相胶为 SDS PAGE 对 BNE 上的蛋白质复合体的亚基进行电泳 分离 然后转膜 利用 Western blot 鉴定玉米组织中 GS同 工酶的亚基组成 玉米叶片中分子量约 460 kD 的 GS 同 工酶 图 2 A 由 44 kD 的亚基组成且信号非常弱 图 3 A 为 GS2 分子量约 410 kD和 240 kD的 GS同工酶由 39 40 kD 的亚基组成且信号非常强 为 GS1 表明胞液型 GS 存 在两种不同的聚合方式 玉米穗柄中只有分子量约410 kD 和240 kD的GS同工酶 也是由39 40 kD的亚基组成 说 明穗柄中 GS1 全酶也存在两种不同的聚合方式 图 2 玉米 GS 同工酶全酶大小鉴定 Fig 2 Identification of the molecular weight of GS holoenzymes A 以 BNE 分离玉米不同组织可溶蛋白 以胶内转移酶活性检测 GS 同工酶 B BNE 胶考马斯亮蓝染色 参照蛋白 marker 利用 Gel Pro analyzer 计算 GS 同工酶全酶大小 C 以 BNE CNE 分离玉米穗位叶可溶蛋白 转膜后进行 Western blot 检测 A Soluble proteins from different tissues of maize were separated by BNE and GS isoforms were detected with an in gel transferase activity assay B CBB staining after BNE the molecular weight of GS holoenzymes were estimated using Gel Pro analyzer with the calibration of the protein marker C Proteins from the ear leaf of maize were separated by BNE CNE and GS isoforms were detected by Western blot 第9期 王小纯等 玉米不同组织器官谷氨酰胺合成酶同工酶表达差异及聚合方式 1413 利用 BNE 计算 GS 同工酶的全酶大小 图 2 利用 BNE 与 SDS PAGE 结合进行两相电泳分离 GS 同工酶亚 基 利用 Western blot 检测鉴定 GS 同工酶亚基组成 图 3 利用 GS 同工酶分子量除以相应亚基的分子量 在 此基础上计算 GS 同工酶聚合状态 GS2 为十聚体 胞 液型 GS1 有 2 种聚合方式 一种为十聚体 和前人结果 一致 15 此外 GS1 同工酶还存在另外一种聚合状态 即五聚体 图 3 玉米 GS 同工酶亚基组成的鉴定 Fig 3 Identification of the subunit composition of GS isoenzymes in maize A 玉米穗位叶 GS 同工酶亚基组成鉴定 利用 BNE 分离叶片可溶蛋白 切取相应泳道进行变性处理 利用 SDS PAGE 分离复合体亚 基 Western blot 检测 GS 亚基 B 穗柄中 GS 同工酶亚基鉴定 方法步骤同 A A Identification of the subunit composition of GS isoenzymes in the ear leaf of maize Proteins were separated by BNE the corresponding gel lane was cut out and denaturalized and the protein complexes were separated by SDS PAGE then the GS subunits were identified by Western blot B Identification of the subunit composition of GS isoenzymes from the pedicel of maize the procedure was the same as that of A 3 讨论 高等植物 2 种 GS 同工酶分别定位于细胞液 GS1 和 质体 GS2 2 23 GS2 缺失在正常条件下是致死性突变 但 通过抑制光呼吸 GS2 突变体能够正常生长发育 证明 GS2 参与光呼吸过程中的氨同化 2 C3植物和 C4植物光 呼吸强度差异巨大 24 小麦 水稻等 C3植物光呼吸强度 很高 GS2表达量更丰富 25 而玉米等C4植物光呼吸强度 要小得多 本研究结果显示仅在玉米叶片中检测到 GS2 少量表达 远远低于 GS1 表达量 与 C4植物光呼吸弱的 生理现象一致 玉米 GS1 基因由 5 个核基因编码 其表达因组织 叶 龄及氮量而异 Gln1 3 和 Gln1 4 在叶片表达量高 26 Gln1 3 决定穗粒数 Gln1 4 调控粒重 13 本研究发现玉米 的穗位节 节间和穗柄组织中有 2 种高表达 GS1 亚基 其 中 39 kD 的 GS1 亚基是组织特异表达 推测 39 kD 的 GS1 可能在玉米灌浆期氮素营养转运方面起着重要作用 由于从植物组织分离纯化足量蛋白的难度非常大 因而 通常采用异源重组植物 GS 研究其结构和聚合方式 10 15 17 BNE CNE 电泳技术用于分离膜蛋白等蛋白质复合物 测 定天然蛋白复合体的相对分子质量 且具有极高的分辨 率 18 19 近年来广泛运用于植物可溶性蛋白的分离鉴定 20 22 本研究通过改良 BNE 电泳技术分离玉米可溶性蛋白 结 合胶内活性测定 2 D 胶和 Western blot 技术 首次发现 玉米叶片有 3 种分子量不同的 GS同工酶 GS2 为十聚体 GS1 主要是十聚体 与 Unno 等 15 利用晶体学 X ray 分析 的玉米 GS1a 是由 2 个五聚环组成的十聚体的结果一致 此外 GS1 还存在少量的五聚体 推测玉米 GS1 的聚合 状态也是一种在氮素代谢中广泛存在的 GS 同工酶调控 方式 References 1 Bernard S M Habash D Z The importance of cytosolic gluta mine synthetase in nitrogen assimilation and recycling New Phytol 2009 182 608 620 2 McNally S F Hirel B Gadal P Mann A F Stewart G R Gluta mine synthetases of higher plants evidence for a specific isoform content related to their possible physiological role and their compartmentation within the leaf Plant Physiol 1983 72 22 25 3 Hirel B Gadal P Glutamine synthetase isoforms in pea leaves intracellular localization Zeitschrift F Pflanzenphysiologie 1981 102 315 319 4 Hirel B Lea P J Ammonia Assimilation Plant Nitrogen Springer Berlin Heidelberg 2001 pp 79 99 5 Zozaya Hinchliffe M Potenza C Ortega J L Sengupta Gopalan C Nitrogen and metabolic regulation of the expression of plas tidic glutamine synthetase in alfalfa Medicago sativa Plant Sci 2005 168 1041 1052 6 Cren M Hirel B Glutamine 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