解淀粉芽孢杆菌的培养基优化及抑菌活性

2017年 第6期 CHINA PLANT PROTECTION 2017 Vol 37 No 6 研究 报告 解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens HAB 7 的培养基优化及抑菌活性 刘文波 熊燕红 秦春秀 靳鹏飞 谢清标 郑服丛 缪卫国 海南省热带生物资源可持续利用重点实验室 海南大学环境与植物保护学院 海南 海口570228 摘要 研究了解解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens HAB 7菌株在不同培养基下生长速率及产生的活性物 质对几种植物病原菌的抑菌活性 采用摇瓶法测定了HAB 7耐盐性及生长速率 平板对峙法测定了其抑菌活性 以 NA培养基为基础培养基 芒果炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides 为靶标菌 研究了不同碳 氮源组合培养基对 HAB 7菌株生长影响 以及对芒果炭疽菌的抑制率 用单因子正交试验 进一步优化碳源 氮源组合培养基 结果表 明 HAB 7菌株在0 20 NaCl g L 含盐量上均能生长 最佳接种时间应在培养24 28 h 在NA LB BPY AYDA BPA及牛肉膏蛋白胨培养基上培养的HAB 7 对8种植物病原真菌平均抑制率分别为53 23 52 03 55 52 52 77 56 58 及53 82 优化后的最佳碳源为蔗糖 10 0 g L 和葡萄糖 10 0 g L 复合碳源 最佳的氮源为酵母粉 20 0 g L 和胰蛋白胨 20 0 g L 复合氮源 单因子正交试验结果显示的碳 氮源为蔗糖30 0 g L 葡萄糖10 0 g L 酵 母粉30 0 g L 胰蛋白胨40 0 g L 对芒果炭疽菌抑菌率为78 3 较BPA培养的HAB 7提高了10 80 活菌数达到 1 97 1010cfu mL 关键词 解淀粉芽孢杆菌 形态观察 培养基优化 抑菌活性 中图分类号 TQ936 2 S436 679文献标识码 A文章编号 1672 6820 2017 06 0005 09 收稿日期 2016 10 26 修回日期 2017 03 20 基金项目 海南省自然科学基金 20153131 海南省产学研项目 CXY20140038 国家农业产业技术体系建设 CARS 34 GW8 农业部 2013年热作农技推广与体系建设项目 13RZNJ 20 作者简介 刘文波 硕士 主要从事热带植物病理研究 E mail saucher 通讯作者 缪卫国 博士 教授 从事分子植物病理等研究 E mail weiguomiao1105 Antifungal activity of Bacillus amyloliquefaciens HAB 7 and optimization of its culture medium Liu Wenbo Xiong Yanhong Qin Chunxiu Jin Pengfei Xie Qingbiao Zheng Fucong Miao Weiguo Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource College of Environment and Plant Protection Hainan University Haikou Hainan 570228 China Abstract Different culture medium was adopted to discover effect of specific growth rate and antifungal activity of active substance produced by strain HAB 7 of Bacillus amyloliquefaciens The shake flask method was employed to determine salt tolerance and growth rate of HAB 7 Antifungal activity was determined by plate confrontation experiments On basis of NA culture medium and mango anthrax fungi Colletotrichum gloeosporioides as target effects of carbon source and nitrogen source on viability of HAB 7 and its inhibition rate to C gloeosporioides were screened Furthermore carbon source and nitrogen source medium combination was optimized by method of single factor orthogonal experiment The results showed that strain HAB 7 could grow on culture medium containing 0 20 NaCl the optimal vaccination time should be incubated at 24 28 h the average inhibition rates were 53 23 52 03 55 52 52 77 56 58 and 5 2017年 第6期 CHINA PLANT PROTECTION 2017 Vol 37 No 6 培 养 基 的 成 分 和 含 量 对 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 Bacillus amyloliquefaciens 的生长繁殖 以及其代 谢产物的产生有重要的影响 1 解淀粉芽孢杆菌通 过代谢产生抗菌蛋白 多肽及低分子量抗生素等活 性物质来抑制植物病原菌 2 解淀粉芽孢杆菌在其 生命活动中 形态及其代谢的活性物质 不仅取决于 本身的遗传特性 还取决于合适的培养基及发酵条 件 3 俞志祥等 4 将8种细菌分别接种在不同的培养 基上 观察到在不同的培养基上8种细菌的菌落形 态存在明显差异 孙亮等 5 将枯草芽孢杆菌HAB 1 接种在7种不同的培养基上 发现HAB 1的菌落形 态存在明显的差异 除了形态的变化外 芽孢杆菌在 不同的培养基及培养条件下 会产生不同的代谢产 物 Mariana等 6 将Bacillus E164菌株接种在不同培 养基上 其不同的上清液对小麦根腐病菌 Bipolaris sorokiniana 的抑菌活性存在差异 孙亮等将枯草芽 孢杆菌 Bacillus subtilis HAB 1接种在不同的培养 基上 发现氮源对HAB 1影响不大 而碳源及金属 离子对HAB 1产生的抑菌活性物质有影响 对同一 种病原菌的抑菌率相差31 33 最小的也相差 2 66 5 王哲等将解淀粉芽孢杆菌KLBMP 033菌 株接种在优化的培养基组分及发酵条件下 对可可 球二孢的抑制率有较大影响 抑制率从53 3 提高 到83 2 1 赵鹏超等将解淀粉芽孢杆菌Q 426菌 株接种在不同组分碳源及氮源上 发现碳源及氮源 能促进其产生抑菌脂肽类物质 7 周青等将解淀粉 芽孢杆菌BS2004菌株接种在经优化的培养基上 优化后对青枯病病菌的抑菌圈直径达21 75 mm 并 且对番茄青枯病的防治效果达80 8 周广麒等优 化了4种培养基成分 优化后的抑菌圈直径由24 mm提高到29 mm 9 吕钊等优化解淀粉芽孢杆菌 D1产抗菌素研究 培养基优化后 抗菌素的抑菌圈 直径由19 2 mm提高到27 2 mm 10 章小洪等研究 表明 氮源和微量元素对解淀粉芽孢杆菌BW 13产 生抗真菌活性物质有影响 抑菌圈比初始试验前提 高了22 7 等 11 目前 过度使用化学杀菌剂 导致日益严重的环 境污染 12 利用生物防治植物病害具有安全性高和 多效性的优点 13 解淀粉芽孢杆菌抑菌范围很广 对 多种植物病害具有抑制作用 14 是很好的生防菌株 候选对象 解淀粉芽孢杆菌产生的活性物质是其抑 制植物病原真菌生长的一个重要复合物 但其抑菌 作用并不单纯靠某个单因子 不同培养基及其组分 会对解淀粉芽孢杆菌产生的抑菌活性物质有影响 对病原菌的抑制作用也有差异 15 本研究拟从一株 解淀粉芽孢杆菌HAB 7对多种植物病原菌的抑制 作用 通过设计合理的培养基组分 来提高分泌的抗 菌活性物质 以达到提高活性物质的产量 为HAB 7菌株大量发酵培养 并获得高产抗菌物质提供参 考依据 1材料与方法 1 1供试菌和培养基 供试细菌菌株HAB 7是本实验室从豇豆根际 土壤中分离获得的一株解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens 4 冰箱保存 供试植物病原真 菌见表1 为本实验室分离鉴定后保存 均经过单孢 分离纯化备用 供试培养基如下 LB培养基 胰蛋白胨10 0 g 酵母粉5 0 g NaCl 5 0 g 蒸馏水1 000 mL BPY培养基 牛肉浸膏5 0 g 蛋白胨10 0 g 酵 母粉5 0 g NaCl 5 0 g 葡萄糖5 0 g 蒸馏水1 000 mL PDB培养基 马铃薯300 g 葡萄糖20 0 g 蒸馏 水1 000 mL BPA培养基 葡萄糖10 0 g 牛肉膏3 0g 胰蛋 53 82 on NA LB BPY AYDA BPA and beef extract peptone medium respectively The optimal carbon source was composed of sucrose 10 0 g L and glucose 10 0 g L The optimal nitrogen source was composed of yeast 20 0 g L and tryptone 20 0 g L source Single factor and orthogonal test demonstrated that inhibition rate of C gloeosporioides was 78 3 which was enhanced by 10 80 than that on BPA medium and viable count was 1 97 1010cfu mL on optimal culture which was composed of 30 0 g L suger 10 0 g L glucose 30 0 g L yeast powder and 40 0 g L tryptone Key words Bacillus amyloliquefaciens morphological observation culture medium optimization antifungal activity 6 2017年 第6期 CHINA PLANT PROTECTION 2017 Vol 37 No 6 病原菌名称拉丁学名来源及寄主 芒果炭疽病病菌Colletotrichum gloeosporioides Penz 海南乐东 芒果 橡胶树炭疽病病菌C gloeosporioides海南儋州 橡胶树 橡胶树炭疽病病菌C gloeosporioides海南三亚 橡胶树 橡胶树炭疽病病菌C gloeosporioides海南琼海 橡胶树 绿橙炭疽病病菌C gloeosporioides海南琼中 绿橙 香蕉炭疽病病菌C musae海南儋州 香蕉 黄瓜炭疽病病菌C orbiculare海南儋州 黄瓜 香蕉枯萎病病菌Fusarium oxysporum f sp cubense本实验室保存 香蕉 脐橙炭疽病病菌C gloeosporioides海南琼中 脐橙 表1供试植物病原真菌 白胨7 5 g 酵母粉1 0 g NA培养基 葡萄糖20 0 g 牛肉膏3 0 g 酵母 粉1 0 g 胰蛋白胨5 0 g AYDA培养基 葡萄糖10 0 g 牛肉膏80 g 酵 母粉5 0 g 牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏3 0 g 胰蛋白胨 10 0 g NaCl 5 0 g 上述培养基除PDB外 pH均为7 0 7 2 16 17 加 入18 g L琼脂粉制作成固体 其中 PDB培养基用 于供试病原真菌的培养 1 2HAB 7菌液制备 用接种环在超净工作台上 从保存HAB 7菌 株的试管中挑取1环HAB 7菌液 在LB培养基平 板上画线 置于28 培养箱中 恒温黑暗培养24 48 h 挑取1个单菌落接种于LB培养基中 28 200 r min恒温振荡培养24 h 得到HAB 7种子液 1 3HAB 7菌株生理活性测定及形态观察 1 3 1耐盐性分析 将1 2制备好HAB 7菌株的种子菌液分别按 1 的接种量接种至0 5 10 15 20 NaCl g L 的牛肉膏蛋白胨液体培养基中 18 不接种种子液 的牛肉膏蛋白胨液体养基作为对照 28 200 r min恒温振荡培养24 h 在分光光度计600 nm处观 察 测定不同条件下菌悬液的吸光度 菌悬液浓度与 分光光度计读数呈正相关 以此来确定细菌的耐盐 范围和能力 1 3 2生长曲线测定 将1 2制备的种子菌液按1 的接种量接种至 LB液体培养基当中 28 200 r min恒温振荡培养 72 h 不接种种子液的LB液体培养基作为对照 在 分光光度计600 nm处间隔4 h测定1次吸光度 绘 制生长曲线 1 3 3HAB 7在不同培养基上形态观察 分 别 接 种HAB 7菌 液 到AYDA BPA BPY LB NA 牛肉膏蛋白胨6种培养基的固体平板中 央 5 每个处理重复3次 72 h后观察菌落形态及拍 照 并用十字交叉法量取菌落大小 1 3 4不同培养基培养HAB 7的抑菌活性测定 分别将植物病原真菌菌饼接种AYDA BPA BPY LB NA 牛肉膏蛋白胨6种培养基平板的中央 位置 在距离中央菌饼等距离的4个角 接种HAB 7菌株 以不接HAB 7菌株的为对照 置于28 恒 温培养箱暗培养 对照组菌落直径长至整个培养皿 的2 3时 用十字交叉法测量对照植物病原真菌菌 落直径 按照方中达的方法测定HAB 7菌株对供试 病原真菌的拮抗作用 16 菌落直径 mm 水平直径 垂直直径 2 抑制率 对照真菌菌落直径 处理真菌菌落直径 对照真菌菌落直径 100 1 4优化培养基的筛选 1 4 1最佳碳源筛选 用2 m V 含量的蔗糖 葡萄糖 玉米粉 麦芽 糖 甘露醇 可溶性淀粉等6种碳源 分别替换基础 培养基NA中的碳源 pH调至7 2 0 2 用100 0 mL 的培养基装到250 mL三角瓶中 121 灭菌20 7 2017年 第6期 CHINA PLANT PROTECTION 2017 Vol 37 No 6 0 40 0 35 0 30 0 25 0 20 0 15 0 10 0 05 0 00 OD600 0 333 0 165 0 089 0 02 0 011 05101520 含盐量 图1解淀粉芽孢杆菌HAB 7菌株在NaCl 不同含量下的生长曲线 3 00 2 50 2 00 1 50 1 00 0 50 0 00 OD600 04812162024283236404448525660646872 时间 h 图2解淀粉芽孢杆菌HAB 7菌株在LB液体培养基上的生长曲线 min 接种量为每个摇瓶中接种1 mL HAB 7种子 液 于28 200 r min恒温振荡培养48 h 19 1 4 2最佳氮源筛选 用2 m V 含量的硝酸铵 硫酸铵 酵母粉 细 菌学蛋白胨 胰蛋白胨 麸皮 牛肉膏 酵母粉 胰蛋 白胨 1 1 酵母粉 胰蛋白胨 硝酸铵 2 2 1 等9种 氮源 分别替换基础培养基NA中的氮 N 源 用 100 0 mL的培养基装到250 mL三角瓶中 121 灭 菌20 min 接种量为每个摇瓶中接种1 mL HAB 7 种子液 于28 200 r min恒温振荡培养48 h 20 1 4 3培养基组分配比优化 根据最佳碳 氮源筛选结果 选用4因素4水平 L16正交表进行正交试验 以确定最适宜HAB 7菌 株生长和产抗菌物质最优的培养基组合 测定方法 同1 3 4 1 5数据分析 所有试验均重复3次 数据采用Excel 2010 SAS9 2和SPSS19 0进行统计 2结果与分析 2 1耐盐性及生长曲线的测定 HAB 7菌株在0 20 的含盐量均能生长 从图 1可以看出 NaCl的浓度对HAB 7影响较大 在0 20 的含盐量范围里 只要改变NaCl的含量就改变 HAB 7的生长速率 但在低浓度下生长较好 浓度 在15 20 时 生长没有什么变化 超过20 HAB 7菌株不生长 说明HAB 7具有一定的耐盐 性 HAB 7菌株在LB液体培养基上0 4h生长曲线 平坦稳定为迟缓期 4 8h曲线增幅变大 逐渐进入 对数生长期 8 12 h曲线直线上升 菌落群体活体 较大 为对数生长期 12 20 h曲线平坦稳定 为稳 定期 20 24 h又有一个对数生长期 说明HAB 7存 在2个对数生长期 24 68 h曲线比较平坦稳定 但 中期28 32 h及36 40 h存在2个小幅度的下降 期 68 h后曲线又开始呈现下降的趋势 进入衰亡 期 图2 说明HAB 7菌株的最佳接种时间应该在 培养24 28 h 这个时段活菌数最多 2 2HAB 7在不同培养基下的形态 HAB 7在不同培养基的菌落形态存在很大的 差别 其菌落在大小 形状 规整等上也存在明显差 异 图3 72 h培养后 HAB 7菌株在NA培养基上 生长的菌落直径最大 表2 2 3HAB 7在6种培养基上对植物病原真菌的抑 制率 HAB 7在BPY培养基上对8种植物病原真菌 的都具有抑制作用 表3 对8种植物病原真菌的 平均抑菌率最高的为56 58 其他依次为55 52 53 82 53 23 52 77 及52 03 由不同培养基 8 2017年 第6期 CHINA PLANT PROTECTION 2017 Vol 37 No 6 a AYDA培养基b BPA培养基c BPY培养基d LB培养基e NA培养基f 牛肉膏蛋白胨培养基 图3解淀粉芽孢杆菌HAB 7菌株在6种培养基上生长的菌落形态 培养基 菌落直径 mm 菌落形态 DA33 25菌落椭圆形 边缘不规则 白色 中间有小褶皱 边缘无 菌落较薄 干燥 粉状 不易从培养基 上挑取 BPA22 00菌落不规则形 边缘波浪状 米白色 表面光滑 菌落较厚 干燥 易从培养基上挑取 BPY28 50菌落圆形 边缘不规则 乳白色 褶皱明显由中心向边缘渐细 网络状 菌落较薄 湿润 不易 从培养基上挑取 LB30 00菌落圆形 规则 米黄色 褶皱呈放射状向边缘辐射 湿润 菌落中心有大的晕圈 易从培养基 上挑取 NA50 00菌落圆形 边缘规则 暗白色 边缘颜色渐浅 菌落较厚 中间有少许褶皱 菌落中心有不明显 的晕圈 菌落较干燥 易从培养基上挑取 牛肉膏蛋白胨16 00菌落不规则 较小 乳白色 中间有褶皱 湿润 粘性较大 不易挑取 表2解淀粉芽孢杆菌HAB 7菌株在6种培养基上生长的菌落形态差异 培养基 抑制率 2 平均抑制率 CGR 2CGR 3CGR 5CGO 1FOC 5CGN 1COC 1CMB 1 NA57 5060 7150 0038 7562 8649 6453 6752 67 53 23 2 24 a 牛肉膏蛋白胨54 4660 3655 0047 1363 9343 9354 6456 07 53 82 2 21 a LB59 6457 5052 5042 1461 9641 4351 9449 10 52 03 2 24 bc BPY62 1461 0558 2139 2966 2548 5748 6160 00 55 52 2 20 bc AYDA58 5760 9359 2934 2960 7143 5750 1454 64 52 77 2 30 c BPA58 2163 5754 2943 5767 5052 8651 9460 71 56 58 2 31 c 表3HAB 7在6种培养基上分别对8植物病原真菌的抑制率 1 1 同列数据后不同小写字母表示差异显著 p 0 05 2 CGR 2 橡胶树炭疽病病菌 CGR 3 橡胶树炭疽病病菌 CGR 5 橡胶树炭疽病病菌 CGO 1 绿橙炭疽病病菌 FOC 5 香蕉枯萎病病菌 CGN 1 脐橙炭疽病病菌 COC 1 黄瓜炭疽病病菌 CMB 1 香蕉炭疽病病菌 组分分析可知 添加了葡萄糖的的抑菌率普遍高于 未添加的或是加的较少的 2 4优化培养基筛选 2 4 1碳源筛选试验 以蔗糖作为碳源时 活菌数最多 达到13 30 107cfu mL 其他依次为葡萄糖 麦芽糖 玉米粉 可 溶性淀粉 甘露醇 抑菌活性显示 蔗糖作为碳源时 HAB 7菌株抑菌活性最强 抑菌圈平均直径为 30 53 mm 其他依次为玉米粉 葡萄糖 麦芽糖 甘露 醇 可溶性淀粉 图4 表4 因此 根据细菌的活菌 数和抑菌活性综合考虑 选用蔗糖 10 g L 和葡萄 糖 10 g L 作为优化培养基的复合碳源 2 4 2氮源筛选试验 以酵母粉为氮源时 活菌数最多 达到21 80 9 2017年 第6期 CHINA PLANT PROTECTION 2017 Vol 37 No 6 CK 对照a 蔗糖b 葡萄糖c 玉米粉d 麦芽糖e 甘露醇f 可溶性淀粉 图4不同碳源培养基培养HAB 7与芒果炭疽病病菌 CGM 2 对峙 碳源活菌数 107cfu mL 抑菌圈直径 mm 抑制率 蔗糖 13 30 0 48 a 30 53 0 38 a67 83 葡萄糖 10 90 0 35 b 28 71 0 54 a63 80 玉米粉 6 80 1 00 c 29 88 1 13 a66 40 麦芽糖 8 10 0 59 d 27 00 0 61 b60 00 甘露醇 3 00 0 25 e 25 07 0 57 b55 70 可溶性淀粉 5 40 0 75 f 21 83 1 13 c48 50 表4不同碳源的培养基培养HAB 7与芒果炭疽菌对峙培养的抑菌差异及活菌数量 1 1 同列数据后不同小写字母表示差异显著 p 0 05 CKabc def CK 对照氮源 N源 a 胰蛋白胨b 酵母粉c 细菌学蛋白胨 d 麸皮e 牛肉膏f 酵母粉 胰蛋白胨 1 1 g 酵母粉 胰蛋白胨 硝酸铵 2 2 1 图5不同氮源培养基培养HAB 7与芒果炭疽病菌 CGM 2 对峙 CKabc defg 10 2017年 第6期 CHINA PLANT PROTECTION 2017 Vol 37 No 6 试验 编号 蔗糖 g L 葡萄糖 g L 酵母粉 g L 胰蛋白胨 g L 活菌数量 108cfu mL 抑菌圈直径 mm 抑菌率 110101010 16 33 2 68 lm 28 20 2 28 i 62 67 2 28 a 210202020 66 00 2 31 f 31 09 2 34 f 69 09 2 34 b 310303030 76 00 2 45 e 31 90 2 37 de 70 89 2 37 bc 410404040 156 33 0 86 c 33 75 2 43 b 75 00 2 43 cd 520102030 50 67 2 24 g 31 64 2 36 ef 70 31 2 36 cd 620201040 23 33 2 47 jk 29 17 2 21 h 64 82 2 30 de 720304010 128 00 0 09 d 32 53 2 31 cd 72 29 2 39 de 820403020 19 33 2 57 kl 30 11 2 42 g 66 89 2 32 e 930103040 196 67 0 81 a 35 24 2 51 a 78 31 2 51 k 1030204030 183 33 0 82 b 33 10 2 29 bc 73 56 2 41 e 1130301020 13 00 1 91 m 32 55 2 26 cd 72 33 2 38 e 1230402010 26 33 1 48 j 31 57 2 13 ef 70 16 2 35 ef 1340104020 42 33 1 26 h 30 33 2 36 g 67 4 2 32 gf 1440203010 33 00 1 37 i 31 82 2 14 def 70 71 2 34 gh 1540302040 61 30 1 12 f 31 35 2 32 ef 69 67 2 35 hi 1640401030 15 67 1 79 lm 29 37 2 30 h 65 27 2 30 i 表6HAB 7对芒果炭疽菌抑制作用最优培养基正交试验结果 1 1 数据后不同小写字母表示差异显著 p 0 05 氮源 比例 活菌数量 107cfu mL 抑菌圈直径 mm 抑菌率 酵母粉 21 80 2 73 a 27 90 0 53 a62 00 细菌学蛋白胨 11 60 3 35 b 27 68 0 94 a61 50 胰蛋白胨 20 23 1 62 bc 27 45 0 25 ab61 00 麸皮 7 70 0 38 bc 26 69 0 33 ab59 30 牛肉膏 6 90 0 53 cd 27 67 0 37 bc61 50 酵母粉 胰蛋白胨 1 1 12 50 1 64 de 25 65 1 22 bc57 00 酵母粉 胰蛋白胨 硝酸铵 2 2 1 15 60 0 87 e 23 63 0 57 c52 50 表5不同氮源的培养基培养HAB 7与芒果炭疽菌对峙培养的抑菌差异及活菌数量 1 1 同列数据后不同小写字母表示差异显著 p 0 05 107cfu mL 其他依次为胰蛋白胨 酵母粉 胰蛋白 胨 硝酸铵 2 2 1 酵母粉 胰蛋白胨 1 1 细菌学蛋 白胨 麸皮 牛肉膏 抑菌活性显示 以酵母粉为氮 源时 菌株的抑菌活性最强 抑菌圈直径为27 90 mm 其他依次为细菌学蛋白胨 酵母粉 牛肉膏 麸皮 酵母粉 胰蛋白胨 1 1 酵母粉 胰蛋白胨 硝 酸铵 2 2 1 图5 表5 用硫酸铵 硝酸铵为氮源 时HAB 7不生长 因此 综合考虑 选用酵母粉 20 g L 和胰蛋白胨 20 g L 作为优化培养基的复 合氮源 2 4 3培养基组分优化 通过正交试验设计对筛选到的最佳碳源 氮源 进行优化 通过对靶标菌芒果炭疽菌 CGM 2 的抑 制作用 最终确定最优培养基 其各组分含量为蔗糖 30 g L 葡萄糖10 g L 酵母粉30 g L 胰蛋白胨40 g L 经最优培养基培养过后活菌数达到1 966 1010 11 2017年 第6期 CHINA PLANT PROTECTION 2017 Vol 37 No 6 cfu mL 抑菌圈直径为35 24 mm 表6 3结论与讨论 生防菌具有好的耐盐性是备受关注的 而且也 是具有重要开发价值的微生物资源 本实验室分类 保存的HAB 7菌株在0 20 的含盐量上均能生长 随着浓度的增加 生长的活性越低 浓度在15 20 时 生长没有什么变化 超过20 HAB 7菌株 不生长 这与耐盐菌地衣芽孢杆菌有明显的差别 18 生长曲线的绘制 可以确定最佳接种时间 在大规模 的发酵时 提供了最佳的活菌数量 通过试验发现 HAB 7菌株的最佳接种时间应该是在培养24 28 h 之间 这个时段活菌数最多 为后续的发酵及提取抗 菌活性物质提供了条件 对同一株解淀粉芽孢杆菌而言 所分泌的抗菌 物质种类是确定的 但是在不同培养基下 Landy培 养基能使Bacillus substilis GEB3及B2菌株产生较 多产量的抗菌态活性物质 21 22 通过单因子试验 在 Landy培养基上更换不同碳 氮源 发现葡萄糖是抗 菌态活性物质产量高的碳源 而L 谷氨酸钠是抗菌 态活性物质产量高氮源 17 23 25 说明培养基的组成 成分对芽孢杆菌的抗菌态活性物质及积累有显著的 影响 7 HAB 7菌株在NA BPA BPY LB AYDA 牛 肉膏蛋白胨等6种培养基上培养 分别在菌落形态 颜色 褶皱程度及大小上有差异 在NA培养基上生 长最快 HAB 7达到了50 mm 不同培养基会产生 不同的适应性 而且形态也会发生变化 4 5 不同培 养基培养的HAB 7对8种植物病原真菌的平均抑 制 率 分 别 为53 23 52 03 55 52 52 77 56 58 及53 82 BYP培养基培养的HAB 7对香 蕉枯萎病病菌的抑制率达到66 25 而AYDA培养 基培养的HAB 7对绿橙炭疽病病菌的抑制率也达 34 29 说明HAB 7菌株对植物病原真菌具有较广 谱的抗性 26 碳源和氮源是细菌抗菌活性物质合成 所必需的营养成分 经过不同碳 氮源的筛选 HAB 7能有效的利用蔗糖和葡萄糖复合碳源 酵母粉和 胰蛋白胨复合氮源 并能提高其活菌数和抑制效果 采用摇瓶发酵的方法通过单因子正交试验 选取芒 果炭疽菌 CGM 2 作为试验的指示植物病原真菌 组合中最好的抑制圈直径为35 24 mm 抑菌率为 78 31 较BPA培养的HAB 7提高了10 80 对 比上述6种不同培养基中 比最好的抑制率还要提 高12 05 与周广麒等研究报道的相一致 9 筛选 得到最适合HAB 7菌株生长及其抑菌物质产生的 培养基 蔗糖30 g L 葡萄糖10 g L 酵母粉30 g L 胰蛋白胨40 g L 优化后的HAB 7菌株的活菌数达 到了1 97 1010cfu mL 综合这些数据分析可知 添 加了葡萄糖的抑菌率普遍高于未添加的或是加的较 少的 HAB 7菌株分泌活性物对病原菌的影响因素 可能与碳源有关 这与解淀粉芽孢杆菌Q 436及 ES 2菌株报道一致 7 17 23 氮源中 HAB 7菌株最最 有效利用的是酵母粉 胰蛋白胨 而与解淀粉芽孢杆 菌Q 436及ES 2菌株有差异 7 17 说明不同来源的 解淀粉芽孢杆菌在营养的有效利用上是不同的 硫 酸铵 硝酸铵为氮源时HAB 7不生长 HAB 7菌株 可能不以这两种物质为氮源 本研究结果表明 HAB 7菌株具有一定耐盐 性 不同培养基及其碳 氮源的混合比对HAB 7菌 株的生长及对植物病原真菌的抑菌活性有影响 优化后的碳 氮源能提高HAB 7菌株的活菌数 并 提高对植物病原菌的抑菌效果 具有潜在的应用 价值 参考文献 1 王哲 曹成亮 左飞 等 杨树变色真菌生防细菌 KLBMP 033发酵条件优化 J 林业实用技术 2011 11 3 7 2 Chen X H Koumoutsi A Scholz R et al Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth promoting bacteriumBacillusamLoliquefaciens FZB42 J Nature Biotechnology 2007 25 1007 1014 3 李鑫 解淀粉芽孢杆菌HRH317产抑菌物质发酵条件 及其稳定性研究 D 太谷 山西农业大学 2014 4 俞志祥 马宏 胡斌 等 常见致食物中毒病原菌在不同 培养基上菌落形态分析 J 现代预防医学 2005 32 12 1808 1810 5 孙亮 刘文波 杨廷雅 等 Bacillus subtilis HAB 1在不 同培养基下的形态观察及抑菌活性测定 J 广东农业 科学 2013 13 76 80 6 Mariana C M Monique S G Jos C G et al Antifungal activity of Bacillus sp E164 against Bipolaris sorokiniana J Biociencias 2009 17 1 48 58 12 2017年 第6期 CHINA PLANT PROTECTION 2017 Vol 37 No 6 7 赵朋超 权春善 金黎明 等 氮源和碳源对解淀粉芽孢 杆菌Q 426抗菌脂肽合成的影响 J 中国生物工程杂 志 2012 32 10 50 56 8 周青 王笑 苏婷 等 青枯病和根肿病生防细菌 BS2004的发酵培养基和培养条件优化 J 中国生物 防治学报 2012 28 4 537 544 9 周广麒 马蓬勃 刘俏 等 解淀粉芽孢杆菌Q 426培养 基优化及抑菌活性的预测 J 中国生物工程杂志 2013 33 11 21 26 10 吕钊 张丽萍 程辉彩 等 响应面法优化解淀粉芽孢 杆菌D1产抗菌素培养基研究 J 北方园艺 2013 5 94 97 11 章小洪 汪琨 朱廷恒 等 解淀粉芽孢杆菌BW 13 培养基和培养条件优化 J 浙 江 工业大学 学 报 2013 41 1 35 39 12 Park J H Choi G J Jang K S et al Antifungal activity against plant pathogenic fungi of chaetoviridins isolated from Chaetomium globosum J FEMS Microbiology Letters 2005 252 2 309 313 13 Gabriele B Christin Z Jana L et al Impact of plant species and site on rhizosphere associated fungi antago nistic to Verticillium dahliae kleb J Applied And En vironmental Microbiology 2005 71 8 4203 4213 14 Mercado B J Rodriguez J D Hervas A et al Sup pression of Verticillium wilt in olive planting stocks by root associated fluorescent Pseudomonas spp J Biologi cal Control 2004 30