生姜茎基腐病病原鉴定及甲壳胺对其病原菌的抑菌作用VIP

生姜茎基腐病病原鉴定及甲壳胺对其病原 菌的抑菌作用 胡鲜梅 1 2 李长松1 曹亚栋1 徐作珽1 张悦丽1 齐军山1 马立国1 张 博 1 孙明伟3 芮法富3 1山东省农业科学院植物保护研究所 山东省植物病毒学重点实验室 山东济南 250100 2山东农业大学 植物保护学院 山东泰安 271001 3济南阿波罗甲壳素肥业有限公司 山东济南 250101 摘 要 通过形态学观察 致病性测定及序列分析 对生姜茎基腐病病原菌进行鉴定 并采用菌丝生长速率法 活体组 织法和田间试验研究甲壳胺对生姜茎基腐病病原菌的抑菌活性 结果表明 生姜茎基腐病病原菌为群结腐霉 Pythium myriotylum 刺腐霉 Pythium spinosum 和林栖腐霉 Pythium sylvaticum 甲壳胺对 3 种腐霉菌均有抑制作用 抑制中浓 度 EC50 分别为 422 711 2 401 699 5 446 910 7 g mL 1 显微观察显示 甲壳胺处理后的腐霉菌丝膨大 扭曲 分枝增多 菌丝内部出现空泡化 活体组织法试验结果表明 甲壳胺可以明显抑制生姜茎基腐病的发生 田间防治试验结果表明 甲壳 胺可以明显预防生姜茎基腐病的发生 从而提高生姜产量 关键词 生姜 茎基腐病 形态特征 序列分析 甲壳胺 抑菌活性 腐霉 P complectens 终极腐霉 P ultimum 群 结腐霉 P myriotylum 钟器腐霉 P vexans 禾生腐霉 P graminicola 刺腐霉 P spinosum 和德里腐霉 P deliense 等都可在国外不同国家 和地区引起生姜茎基腐病的发生 国内生姜茎基 腐病病原菌有瓜果腐霉 P aphanidermatum 喙 腐霉 P rostratum Butler 周雄腐霉 P periilum Drechsler 群结腐霉 P myriotylum 禾生腐霉 P graminicola 和腐霉 P monospermum 等 姜子 德和戚佩坤 1992 李林 等 2009 生姜茎基腐病是典型的土传病害和种子传 播病害 其无性繁殖体游动孢子可随水流在土壤 中传播 与生姜根系或茎基接触后侵入组织致其 发病 而后迅速向上扩展蔓延 引起叶片黄化 叶枯乃至植株枯死 寄主发病后 在发病部位表 面能产生大量孢子囊和游动孢子 可以进行多次 再 侵 染 Ichitanit Shinsu 1980 Davis 1991 Ravindren Nirmal 2005 目前防治茎基腐病的 方法主要是化学防治 但是从环境安全和人类健康 角度考虑 急需寻找安全有效的生物防治方法和途 径 Stirling 2009 Pandey 2010 胡 鲜 梅 女 硕 士 研 究 生 主 要 从 事 蔬 菜 病 害 研 究 E mail xianmeihu 通讯作者 Corresponding author 李长松 研究员 硕士生导师 主 要从事植物病害与防治研究 E mail lics1011 收稿日期 2017 04 26 接受日期 2017 06 23 基金项目 国家重点研发计划项目 2017YFD0201605 山东省农 业重大应用技术创新项目 山东省农业科学院重大科技创新项目 2014CXZ07 山东省农机装备研发创新计划项目 山东省生姜栽培由来已久 近年来随着生姜 种植面积的不断扩大 病害发生也呈上升趋势 尤其是生姜茎基腐病的发生十分严重 给姜农带 来巨大的经济损失 已成为生姜生产中的主要病害 之一 1907 年 Butler 首次报道绚丽腐霉 Pythium gracile 侵染可引起生姜茎基腐病的发生 Butler 1907 截至目前 已发现的能引起生姜茎基腐 病的腐霉病原菌有 10 余种 而关于该病的病原 菌 国内外报道不尽一致 由于地理环境及气候 的差异 导致不同国家及地区间病原菌优势种类 有较大差异 元菊丹 2011 如瓜果腐霉 P aphanidermatum 巴特勒腐霉 P butleri 完整 57 57 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES2017 12 57 62 中国蔬菜 学术论文下载 www c n v e g o r g 甲壳胺 又名壳聚糖 脱乙酰甲壳质 可溶性 甲壳质 几丁聚糖 脱乙酰几丁质 聚氨基葡糖 是一种天然多糖类高分子化合物 在自然界中广泛 存在 由于其生物相容性 无毒性 抗菌性 可生 物降解等优点 近年来在农业上的应用日趋广泛 李 牧 2007 前人研究表明 甲壳胺对番茄叶霉病 菌的孢子萌发和菌丝体生长均具有明显抑制作用 李美芹 2007 随着浓度的提高 甲壳胺对樱 桃番茄腐败菌的抑制作用增强 马菲 2013 甲 壳胺作为激发子 可有效诱导植物抗病性 增强植 物对病害的防御能力 许珍 2012 本试验通过 形态学观察 致病性测定及序列分析 对生姜茎基 腐病病原菌进行鉴定 并采用菌丝生长速率法 活 体组织法和田间试验研究甲壳胺对生姜茎基腐病病 原菌的抑菌活性 旨在为防治生姜茎基腐病和绿色 药剂的开发提供参考 1 材料与方法 1 1 试验材料 供试菌种 Pythium myriotylum Pythium spinosum Pythium sylvaticum 分离于 2015 年安丘 明显感染茎基腐病的生姜姜块上 供试培养基 水琼脂培养基 WA 100 mL 无 菌水中加入 1 g 琼脂 马铃薯琼脂培养基 PDA 马铃薯 200 g 葡萄糖 20 g 琼脂 15 20 g 无菌 水 1 000 mL CMA 培养基 玉米粒 60 g 琼脂 20 g 蒸馏水 1 000 mL 玉米粒 VP3培养基 Ali Shtayeh et al 1986 皮氏液 Ca NO3 2 0 4 g KH2PO4 0 15 g Mg NO3 2 0 15 g CaCl2 0 06 g 蒸 馏 水 1 000 mL 121 蒸汽灭菌 15 20 min 1 2 试验方法 1 2 1 病原菌分离及显微镜观察 将采集的带病姜 块用水冲洗干净 用消毒医用手术刀将发病姜块病 健交界处切成小块 放入纱袋中 用流水冲洗 12 h 取出组织小块 用灭菌滤纸吸干表面水分后 置于 WA 培养基上 于 25 培养箱中培养 待长出新 鲜菌丝及时用菌丝顶端分离技术分离数代后 得到 单一菌种 将得到的单一菌种置于 CMA 平板上 25 黑暗条件下培养 48 h 挑取边缘菌丝块转入皮氏 液 放置于 25 培养箱诱发培养 每隔 1 h 挑 取菌丝在显微镜下对孢子囊 卵孢子 藏卵器及 雄器进行观察并照相 测量成熟的孢子囊 雄 器 藏卵器及卵孢子大小 每项指标分别观察测 量 200 个 并计算其平均值 刘振伟和史秀娟 2009 根据余永年 1998 主编的 中国真菌志 第 六卷 霜霉目 的检索表及描述 对菌丝体 孢子 囊 雄器 藏卵器及卵孢子的形态特征 有关特性 以及菌落形态等进行鉴定 1 2 2 致病性测定 将玉米粒煮熟灭菌 在无菌操 作台中接种病原菌 25 培养 48 h 灭菌玉米粒长 满待测病原菌 将每 1 kg 灭菌土与 50 g 带菌玉米 粒混匀 对照用不接菌的玉米粒与灭菌土混匀 分 别种入健康的姜块 适时浇水 保持一定的土壤湿 度 接种 60 d 后调查 记录发病症状 1 2 3 致病菌测序鉴定 用灭菌的解剖刀刮取 PDA 平板上的菌丝 放入研钵中 加入液氮迅速研磨 采用 Biospin 植物基因组 DNA 提取试剂盒 杭州博 日科技有限公司 提取供试菌株的 DNA 用特异 性引物 ITS1 和 ITS4 扩增 将扩增条带经过测序得 到的 rDNA ITS 序列与 GenBank 中已有的相关菌株 的 ITS 序列进行同源比对 利用 MEGA 5 2 等相关 生物学软件进行序列比对 分析同源性 并构建系 统发育树 1 2 4 不同浓度甲壳胺的抑菌试验 采用菌丝生长 速率法测定甲壳胺对病原真菌腐霉菌的抑菌活性 将甲壳胺加入到 45 mL 灭菌 PDA 中配成不同浓度 的培养基 摇匀 冷却 接种 在 25 条件下培 养并逐日观察病原菌的生长情况 以不加药剂为对 照 待对照组菌落几近长满平板时 测量各处理菌 落直径 计算菌丝生长抑制率 将各自数据分别带 入 DPS 数据处理系统 得到 EC50值 对照组菌落直径 5 处理组菌落直径 5 对照组菌落直径 5 抑菌率 100 1 2 5 甲壳胺对腐霉菌菌丝形态的影响 从培养 2 d 的腐霉菌菌落边缘打取 5 mm 的试菌饼 接种于 100 mL 含 0 4 mg mL 1甲壳胺的液体 PDA 培养基 的三角瓶中 每瓶接 5 块 每处理 3 次重复 以不 含甲壳胺的PDA培养基为对照 于25 120 r min 1 振荡培养 48 h 挑取菌丝体 显微镜观察并照相 1 2 6 田间防治试验 田间试验于 2016 年在安丘 58 58 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 中国蔬菜 学术论文下载 www c n v e g o r g 市景芝镇孙家沙浯村进行 该地区 2015 年生姜茎 基腐病发病率 85 几乎绝产 试验设 3 个处理 T1 每 667 m2施棉隆 30 kg 熏蒸 25 d 揭膜翻晾 10 d 旋耕前每 667 m2施甲壳胺有机肥 济南阿波 罗公司 有机质 45 下同 200 kg 作底肥 种 前沟施有机肥 100 kg 摆好姜种喷施养根素 甲壳 胺 60 g L 1 1 L 之后分别于第 1 次 第 2 次浇水 小培土 大培土时施养根素 1 L 小培土 大培土 时分别施甲壳胺有机肥 济南阿波罗公司 120 kg 和80 kg T2处理根据当地生物菌肥常用施肥方法 每 667 m2施棉隆 30 kg 熏蒸 25 d 揭膜翻晾 10 d 旋耕前施微生物菌剂凯迪瑞 含枯草芽孢杆菌 2 亿 个 g 1 160 kg 作底肥 种前沟施微生物菌剂凯迪 瑞 80 kg 微生物菌扩培剂 宝地生 扬州博轩生 物技术有限公司 4 8 kg 对照 CK 按照当地施 肥习惯 每 667 m2旋耕前施土杂肥 3 m3 生物有机 肥 益生元 京青中信科技有限公司 100 kg 种 前沟施生物有机肥 益生元 京青中信科技有限公 司 100 kg 0 5 阿维菌素颗粒剂 1 2 kg 以防治线 虫病害 2016 年 4 月 10 日播种 小区面积 50 m2 4 次重复 顺序排列 收获前调查生姜茎基腐病发病情况 每小区 80 株 计算病情指数和防治效果 生姜茎基腐病 分级标准 0 级 无症状 1 级 1 25 叶片有 发病症状 2 级 26 50 叶片有发病症状 3 级 51 75 叶片有发病症状 4 级 76 以上的植 株倒伏 枯死 10 月 10 日收获 每小区收获生姜 6 m2 测产量 2 结果与分析 2 1 病原菌的形态特征 群结腐霉菌落在 CMA 培养基上无特定形态 菌丝发达 分枝 粗 3 1 7 0 m 平均为 4 5 m 孢子囊由膨大与不膨大菌丝共同组成 膨大 部分呈指状或裂瓣状 顶生或间生 平均为 216 m 15 m 藏卵器球形或近球形 平滑 顶生 或间生 偶有 2 个串生 直径 20 31 m 平均 为 25 2 m 雄器棒状或钩状 着生于分枝的雄器 柄顶端 与藏卵器异丝生 以顶端与藏卵器接触 图 1 林栖腐霉菌落在 CMA 培养基上呈放射状 有 气生菌丝产生 菌丝较粗 直径 3 5 10 5 m 菌丝膨大体形态多样 球形 柠檬形 间生或 顶生 球形菌丝膨大体直径为 18 7 24 2 m 平均为 19 7 m 柠檬形菌丝膨大体平均为 17 9 m 23 3 m 不产生游动孢子 藏卵器光滑 多数间生 雄器异丝生 在接近藏卵器处形成二叉 分枝 卵孢子不满器 图 2 图 1 群结腐霉 Pythium myriotylum 的形态特征 a b 孢子囊 c f 藏卵器 雄器与卵孢子 彩色图版见 中国蔬菜 网站 veg org 下图同 图 2 林栖腐霉 Pythium sylvaticum 的形态特征 a b 菌丝膨大体 c d 藏卵器与雄器 刺腐霉菌落在 CMA 培养基上呈放射状 菌丝 无隔 老熟菌丝有隔 发达 不规则分枝 菌丝粗 4 1 7 3 m 菌丝膨大体球形 顶生 间生或切 生 顶生时偶见生于主干菌丝的短小分枝上 直径 10 32 m 平均为 18 7 m 萌发产生芽管 藏 卵器球形 间生或顶生 偶有切生 直径 13 25 m 平均为 19 2 m 藏卵器上均匀分布指状突 起 突起物绝大多数直立 较少弯曲 雄器棍棒 a a b b c c d def 59 59 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 中国蔬菜 学术论文下载 www c n v e g o r g 2 2 致病性测定 致病性测定结果表明 群结腐霉 刺腐霉 林栖腐霉对生姜均具有致病性 接种 1 个月后 生 姜茎基部接种点周围呈水渍状 维管束变褐 茎基 部缢缩 甚至倒伏 叶片发黄萎蔫 与田间自然发 病植株症状类似 从根 茎基部病组织上重新分离 的病原菌与田间植株上分离的病原菌的菌落 孢子 囊 藏卵器等形态完全一致 结果符合 Koch 法则 2 3 序列分析 将测序得到的 rDNA ITS 序列与 GenBank 中 已有的相关菌株的 ITS 序列进行同源比对 结果表 明 分离到的菌株 Q C L 分别与群结腐霉 P myriotylum 刺腐霉 P spinosum 林栖腐霉 P sylvaticum 的相似性最高 同源性可达 100 从 GenBank 中 下 载 不 同 种 的 腐 霉 菌 ITS 序 列 采 用 MEGA 软 件 以 Neighbor Joining 计 算 法 构 建 基 于 ITS 序 列 的 系 统 发 育 树 图 4 从 系 统 发 育 树 可 以 看 出 C L Q 分别与 P spinosum P sylvaticum P myriotylum 在同一分枝上 同源关系较近 结 合形态分析 可知 C L Q 分别为刺腐霉 P spinosum 林栖腐霉 P sylvaticum 群结腐霉 P myriotylum 2 4 甲壳胺对 3 种腐霉菌的抑制作用 试验结果表明 表 1 甲壳胺对 3 种腐霉菌 的抑制中浓度均在 400 500 g mL 1之间 抑菌 效果明显 2 5 甲壳胺对腐霉菌丝形态的影响 显微照相观察显示 甲壳胺处理后的菌丝膨 大 扭曲 分枝增多 菌丝内部出现空泡化 图 5 与 Benhamou 1992 的描述一致 图 4 基于 ITS 序列构建的腐霉菌系统发育进化树 2 6 田间防治试验 从表 2 可以看出 T1 甲壳胺处理 对生姜 茎基腐病的防治效果可达到 98 02 比对照增产 51 14 与 T2 处理相比 防治效果提高了 3 23 个 百分点 产量增加了 35 33 表明甲壳胺可以预 防生姜茎基腐病的发生 进而提高产量 而且对环 境友好 有较高的投产使用优势 表 1 甲壳胺对 3 种腐霉菌的抑制作用 腐霉菌回归方程 相关系数 r 抑制中浓度 EC50 g mL 1 群结腐霉Y 0 924 7 2 256 1 x 0 981 9422 711 2 刺腐霉Y 0 472 8 2 101 8 x 0 981 7401 699 5 林栖腐霉Y 2 592 0 2 864 7 x 0 974 5446 910 7 图 3 刺腐霉 Pythium spinosum 的形态特征 a d 藏卵器和雄器 abcd 状或弯棍棒状 顶生 与藏卵器同丝生 较少异丝 生 罕无柄 每个藏卵器有 1 3 个雄器 卵孢子 球形 平滑 满器 偶有不满器的 直径 12 22 m 平 均 为 17 3 m 壁 厚 0 9 1 7 m 平均为 1 49 m 内含贮物球和折光体各 1 个 图 3 C LN867319 1 Pythium spinosum LT670911 1 Pythium ultimum AB780661 1 Pythium splendens LC143222 1 Pythium aphanidermatum KT827283 1 Pythium dissotocum AB248912 2 Pythium scleroteichum HQ643973 1 Pythium zingiberis KJ595475 1 Pythium dissimile KJ944486 1 Pythium oligandrum JX042487 1 Pythium diclinum KT827283 1 Pythium dissotocum AB248912 1 Pythium scleroteichum LC143222 1 Pythium ahanidermatum HQ643383 1 Pythium helicoides KT716818 1 Pythium nagaii KU833269 1 Pythium debaryanum L LC150561 1 Pythium sylvaticum AB948188 1 Pythium chamaehyphon KJ944486 1 Pythium oligandrum Q KX463037 1 Pythium myriotylum KU833269 1 Pythium debaryanum HQ643383 1 Pyhtopythium helicoides AB248912 1 Pythium scleroteichum LC143222 1 Pythium aphanidermatum LC150561 1 Pythium sylvaticum KT827283 1 Pythium dissotocum 60 60 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 中国蔬菜 学术论文下载 www c n v e g o r g 表 2 安丘市景芝镇生姜茎基腐病防治试验 处理病情指数防治效果 产量 kg 667 m2 1 T11 02 aA98 024 168 36 aA T22 68 aA94 793 079 94 bB CK51 46 bB 2 757 92 cC 注 表中同列数据后不同小写字母表示差异显著 0 05 不同大写字母表示差异极显著 0 01 3 结论与讨论 甲壳胺是一种天然多糖类高分子化合物 在自 然界中广泛存在 由于天然无毒 环境友好的特性 使得其在农业 医药 食品 化工 化妆品 水处 理 金属提取及回收 生化和生物医学工程等诸多 领域的应用研究取得了重大进展 余雄伟 2011 研究发现 甲壳胺对细菌细胞膜的通透性有破坏作 用 细菌核内物质渗漏 最终导致菌体死亡 王云 光 2015 研究发现 低分子量的甲壳胺可降低真 菌菌丝内麦角固醇的含量 并通过破坏细胞壁和细 胞膜的完整性 进入细胞内部对细胞器造成破坏 导致细胞内容物的流失 荆迎军等 2006 研究 了 10 个分子量的甲壳胺对 6 种细菌的抑菌性 结 果表明 甲壳胺的抑菌机理有可能是影响细胞膜的 透性 本试验鉴定得到 3 种生姜茎基腐病病原菌 群结腐霉 Pythium myriotylum 刺腐霉 Pythium spinosum 和林栖腐霉 Pythium sylvaticum 通过 室内菌丝生长抑制法和室外田间试验测定了甲壳 胺对腐霉菌的抑制作用 结果表明甲壳胺可使菌丝 肿胀变形 分枝增多 菌丝内部出现空泡化 与前 人的研究结果一致 但是甲壳胺对腐霉菌丝形态的 影响机理还不够完善 需做进一步研究 田间试验 中通过施用含甲壳胺的有机肥作基肥和追肥 同时 在种植 浇水和培土时沟施甲壳胺表现出较好的防 病增产效果 证明田间通过土壤熏蒸处理结合施用 甲壳胺或微生物制剂 可以较好地控制生姜茎基腐 病 本试验还对安丘和昌邑的生姜茎基腐病地块进 行土壤含菌量测定 不发病地块每克土壤含菌量为 10 100 个 重病地块每克土壤含菌量为 800 2 500 个 表明腐霉菌含量越高 生姜茎基腐病发病就越 重 甲壳胺对田间生姜茎基腐病的预防增产结果可 能与甲壳胺抑制土壤中腐霉的含量有关 综上可知 新型生物农药甲壳胺具有高效的抑 菌效果 可有效减少生姜茎基腐病的发生 是防治 生姜茎基腐病的优秀生物替代制剂 具有良好的开 发前景和工业生产潜力 参考文献 姜子德 戚佩坤 1992 腐霉对姜根茎腐烂的作用 华南农业大学 学报 4 97 101 荆迎军 郝友进 渠晖 单颖 李德森 杜荣骞 2006 壳聚糖的 抑菌活性分析及其抑菌机理的研究 中国抗生素杂志 6 361 365 李林 李长松 徐作珽 齐军山 李凡 2009 生姜根茎腐病的发 生与防治 中国蔬菜 15 22 24 李美芹 2007 壳聚糖抑制番茄叶霉病菌的活性与诱导抗性及其机 理研究 博士论文 青岛 中国海洋大学 李牧 2007 壳聚糖的性质及应用研究 科技信息 科学教研 20 52 53 刘振伟 史秀娟 2009 莱芜生姜茎腐病的病原鉴定 中国植保导 刊 29 7 9 11 马菲 2013 樱桃番茄壳聚糖涂膜效果及改进研究 硕士论 文 北京 中国农业科学院 王云光 2015 低分子量的壳聚糖的抗真菌活性及水果保鲜作 用 硕士论文 武汉 华中农业大学 许珍 2012 壳寡糖新型生物农药的研制及应用研究 硕士论 文 武汉 华中农业大学 余雄伟 2011 壳聚糖抑菌机理研究 硕士论文 武汉 武汉工 业学院 余永年 1998 中国真菌志 第六卷 霜霉目 北京 科学出版 社 1 139 元菊丹 2011 山东生姜茎基腐病病原鉴定及防治研究 硕士论 文 曲阜 曲阜师范大学 Ali Shtayeh M S Len L H C Dick M W 1986 An improved method and medium for quantitative estimates of populations of Pythium 图 5 甲壳胺对腐霉菌丝形态的影响 400 a c 分别为未处理的群结腐霉 刺腐霉 林栖腐霉 d f 分别为 0 4 mg L 1甲壳胺处理的群结腐霉 刺腐霉 林栖腐霉 abcdef 61 61 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 中国蔬菜 学术论文下载 www c n v e g o r g species from soil Transactions of the British Mycological Society 86 1 39 47 Benhamou N 1992 Ultrastructural and cytochemical aspects of chitosan on Fusarium oxysporum f sp radices lycopersici agent of tomato crown and root rot Phytopathology 82 1185 1193 Butler E J 1907 An account of the genus Pythium and some Chytridiaceae Mem Dep Agric India Bot Ser 1 1 162 Davis J R 1991 Soil Solarisation Boca Raton CRC Press 23 27 Ichitanit T Shinsu T 1980 Pythium zingiberum causing rhizome rot of ginger plant and its distribution Ann Phytopathol Soc Jpn 46 4 435 441 Pandey A K Awasthi L P Srivastva J P Sharma N K 2010 Management of ginger Zingiber officinale Rosc rhizome rot in Darjeeling and Sikkim Himalayan region J Phytol 2 9 18 20 Ravindren P N Nirmal B 2005 Ginger The Genus Zingiber Boca Raton CRC Press 308 316 Stirling G R Turaganivalu U Stirling A M Lomavatu M F Smith M K 2009 Rhizome rot of ginger Zingiber officinale caused by Pythium myriotylum in Fiji and Australia Australasian Plant Pathology 38 5 453 460 Identification of Rhizome Rot Disease Pathogen in Ginger and Chitosan Anti fungal Effect on Pathogen HU Xian mei1 2 LI Chang song1 CAO Ya dong1 XU Zuo ting1 ZHANG Yue li1 QI Jun shan1 MA Li guo1 ZHANG Bo1 SUN Ming wei3 RUI Fa fu3 1Institute of Plant Protection Shandong Academy of Agricultural Sciences Key Laboratory of Plant Virology of Shandong Province Jinan 250100 Shandong China 2Plant Protection College Shandong Agricultural University Tai an 271001 Shandong China 3Jinan Apollo Chitosan Fertilizer Industry Co LTD Jinan 250101 Shandong China Abstract This paper carried out identification on pathogen of rhizome rot disease in ginger by morphological observation pathogenicity test and sequence analysis and studied the antifungal activity of chitosan against ginger rhizome rot disease by mycelium growth rate method in vivo biospy and field experiment The results showed that the pathogen of ginger rot disease was identified as Pythium myriotylum Pythium spinosum and Pythium sylvaticum th