血液病检测技术讲稿.doc

绪论一、 临床血液学检验的概述定义：临床血液学检验是采用各种实验室检查方法和技术来分析和研究血液和造血器官的病理变化，从而阐明血液系统疾病的发病机制，协助诊断、治疗观察和预后判断的一门科学。发展：1.近代血液学2.形态血液学3.免疫血液学4.分子病随着医学科学技术的发展和各学科的相互渗透，当代的临床血液学检验已发生根本性变化。在检验科室内，它已经是一个业务内容广泛、拥有大量自动化精密仪器、由许多具备血液学基础及临床知识和娴熟技术的人员组成的临床专业科室。其业务内容已扩展到包括血细胞计数与形态学分析、红细胞病理相关分析、白细胞病理相关分析以及血栓与止血相关分析等方面。 血细胞计数及形态学 由于实验室检测的自动化，以往的所谓“血常规”正被检测参数更多的全血细胞计数（CBC）所取代。最新一代的血液分析仪，除了通常的CBC项目和白细胞分类计数以外，还可直接计数网织红细胞，包括网织红细胞血红蛋白含量（CHr）和表示网织红细胞成熟程度的多项指标；直接检测有核红细胞数，并可从白细胞总数中自动扣除有核红细胞，以及准确计数血小板总数和计数大型。因为现代血液分析仪作为常规检测的红细胞分布宽度（RDW），比Price-Jones曲线反映红细胞大小分布更为精确和直观。如果将MCV、MCH、MCHC、RDW等5项，结合网织红细胞的多项参数综合分析，必要时再辅以血片红细胞形态学观察，有经验的血液病医师，基本上能较准确地进行各种贫血分类和鉴别诊断。此外，这类仪器在白细胞分类检测百分比时，也报告绝对数。各种白细胞所占百分比是一个相对数，其局限性显而易见。当前不少血液学专家提倡今后只检测各种白细胞的绝对数，因为那才是反映血液中某一细胞真实含量的科学指标。 红细胞病理相关分析 除了上述由血液分析仪给出的各项红细胞指标外，显微镜下的红细胞形态学观测也十分重要，但是现今一般血液检验者对此往往不够重视。Williams血液学第6版将经细胞形态分为12类17种，并介绍了每种形态与疾病的关联，可见这方面有多么丰富的内容。其他与红细胞疾病相关的检验还有：与遗传有关的溶血性贫血和高铁血红蛋白血症患者红细胞内各种酶的测定、异常血红蛋白分析和红细胞膜骨架蛋白等的检测。以往分析这些蛋白质，多采用繁琐的生物化学法，耗时、费钱、技术要求高；虽然有一部分后来有了专用的商品试剂，但也难以推广。由于这些蛋白质的基因序列绝大部分已查明，目前生化方法正逐步被已相当成熟的分子生物学方法（如PCR、核酸分子杂交，基因或蛋白质芯片技术等）所取代。白细胞病理相关分析 当前，用自动化血液分析仪进行白细胞分类，虽然已经取得长足进步，但尚未达到完全取代手工镜下分类的程度。它还不能准确辨认各类幼稚细胞、原始细胞以及诸如中性粒细胞的“毒性”变化和“不典型淋巴细胞”等，必要时还必须在显微镜下进行识别。事实上，外周血白细胞的构成十分复杂，单用一般染色和镜检也不可能达到准确分类。例如，看来似乎比较单一的外周血淋巴细胞，实际上是由T细胞、B细胞和自然杀伤（NK）细胞所构成，其中T细胞还可再分成许多亚群。这些细胞在显微镜下是无法区分的，必须用特异的抗淋巴细胞分化抗原群（CD）单克隆抗体，建立免疫方法（如流式细胞术）进行免疫表型检测。粒细胞、单核细胞甚至血小板等也是如此，这些分化抗原目前也采用CD编号。对临床有重要意义，大小接近白细胞的巨大血小板和大小类似血小板的白细胞碎片和红细胞碎片，在血液分析仪和肉眼镜下往往也不易与血小板区分，只能用免疫学方法加以鉴别。血栓与止血相关分析 血栓与止血相关的检验，是近年来临床血液学发展最快的领域。近10年来，由于在凝血、抗凝和纤维蛋白溶解机制及其相互关系方面进行了一系列基础性研究，在止血与血栓形成理论和实践上取得了重大突破。许多新的凝血、抗凝、纤溶因子抑制物的发现及检测方法的建立、自动化仪器的普及和试剂的商品化开发，带动了血栓与止血检验技术的发展，成为临床血液学检验的新亮点。 目前，这一类检验的工作量很大，在发达国家估计已占血液学检验的1/3。中华医学会检验学分会与中华医学会血液分会血栓与止血专业委员会在1997年烟台会议上联合提出了与国际接轨的PT、APTT和纤维蛋白原测定标准化方案的建议；同时建议淘汰玻片法凝血时间和Duke出血时间（需要时可用模板式出血时间法测定）。 目前，我国一般中等以上医院，大都开展“内源”、“外源”和“共同”途径凝血因子的过筛试验（如 PT、APTT、T.T等）和常用凝血因子测定。在抗凝因子方面抗凝血酶，蛋白C、蛋白S测定也日益普及。在纤维蛋白（原）降解产物（FDP），D-二聚体测定已相当普及。在止血功能方面血小板计数、出血时间测定方法的改进和规范化、血小板活化标志物和vWF等的检测，为临床出血性疾病和血栓病（如心、脑血管栓塞等）的诊断、判断患者是否处于高凝状态和抗凝治疗的监控等，提供了许多新的检测指标。与其他临床检验一样，分子生物学方法在血栓与止血检验，特别是遗传性出、凝血异常和血栓检验工作者，近年来在这方面已经取得不少重大成果，有的已达到国际先进水平。血细胞分析仪的发展血细胞分析仪的发展已有50年历史了，国内医院应用血细胞分析仪的情况也越来越普及。近年来由于综合性高科技的飞速发展，血细胞分析仪上也不断采用了最新的电子、光学、化学和计算机技术，从而不断满足临床工作对血液细胞分析的要求。提供更加方便适用、更多功能和参数、更加准确、更快速度的血细胞分析仪，已经是各血细胞分析仪生产厂商的目标。二、 临床血液学检验和临床的关系1.血液系统的疾病常具有非血液系统表现的临床特征。2.许多非血液疾病也可以出现血液系统的变化。3.非血液系统疾病可以同时合并存在血液系统疾病。三、 学习临床血液学检验的方法和要求1. 基础理论与检验实践相结合。2. 临床血液学检验的学习，要做到检验和临床相结合。3. 临床血液学检验是一门实践性很强的应用学科，要求检验人员积极认真、一丝不苟、严谨有序、勤学苦练，在长期的实践中不断积累经验，不断提高有关的基础、临床和检验的知识。第一篇造血细胞及其检验第一章现代造血理论第一节造血器官和造血微环境一、 造血器官造血器官指生成血细胞的器官，包括骨髓、胸腺、淋巴结、肝脏以及脾脏。其中骨髓、胸腺、淋巴结及脾脏又称淋巴器官。人体处于不同的时期，其造血器官有所不同。l一2个月的胎儿，其造血细胞来源于卵黄囊，故卵黄囊为其造血器官。25个月的胎儿，肝脏、脾脏、淋巴结开始造血，产生红细胞、白细胞、血小板，取代了卵黄囊的造血作用。胎儿从第5个月开始出现骨髓造血，胎儿后期出现胸腺造血。婴儿出生后主要是骨髓造血，它能制造红细胞、白细胞、血小板等各种血细胞；脾脏、淋巴结及淋巴组织也造血，但只产生少量的单核细胞、淋巴细胞。成人的造血器官就是骨髓。骨髓是一种海绵样、胶状的脂肪性组织，封闭在坚硬的骨髓腔内。骨髓分红髓(造血细胞)和黄髓(脂肪细胞)两部分。骨髓造血在开始时分布在全身骨路，以后逐渐局限于颅骨、肋骨、胸骨、脊柱、髂骨以及肱骨和股骨的一部分，其他部位逐渐由黄髓所替代。黄髓不能造血。血细胞生成于造血器官，在胚胎期及出生后的不同发育时期，其主要的造血器官并不相同。 （一）胚胎期的造血器官 (1)中胚叶造血期：发生于胚胎的12个月。卵黄囊是最先出现的造血地点。卵黄囊壁上的中胚层间质细胞是造血系统的始基，最初血细胞产生于卵黄囊的血岛，血岛外周的细胞分化发育成原始血细胞，原始血细胞进一步分化为胞浆内具有血红蛋白的初级原始红细胞，即胚胎的血细胞。(2)肝脏造血期：发生于胚胎的25个月。卵黄囊萎缩退化，由肝脏取代其造血功能。它不但能分化初级的原始红细胞，而且能分化为次级原始红细胞，这些细胞逐渐发育成熟为红细胞，经血窦进入血液。此时，肝脏的造血活动甚为活跃。脾脏在胎儿第3个月左右，亦参与造血，主要生成红细胞、粒细胞、淋巴细胞及单核细胞。至第5个月，脾脏造血机能逐渐减退，仅制造淋巴细胞及单核细胞，而这一造血活动则维持终生。(3)骨髓造血期：此期始于胚胎的第4个月。胎儿开始出现骨髓造血组织，最初仅制造粒细胞，继之还制造红细胞和巨核细胞。在骨髓造血的同时，胸腺及淋巴结亦开始造血活动。胸腺生成淋巴细胞，至出生后仍保持此功能；淋巴结则主要生成淋巴细胞及浆细胞，早期也参与制造红细胞。以上3个阶段，彼此相互交错，实际上很难截然分开。（二）是出生后的造血器官 (1)骨髓：骨髓是人体出生后唯一生成红细胞、粒细胞和巨核细胞的造血器官，同时也生成淋巴细胞和单核细胞。从新生儿到4岁的幼儿，全身骨髓具有活跃的造血功能。57岁时，在管状骨的造血细胞之间开始出现脂肪细胞。随着年龄的增长，管状骨中红髓的范围逐渐减少，脂肪组织逐渐增多，骨髓变黄色，称为黄骨髓。黄髓中虽已不再造血，但仍保留有潜在的造血功能。大约在1820岁左右，红髓仅局限于颅骨、胸骨、脊椎、髂骨等扁平骨以及肱骨与股骨的近端。红髓约占骨髓总量的一半。以后红髓的造血活动持续终身，但其活跃程度可随年龄的增长而稍有减少。肉眼观察骨髓是一种海绵状、胶状或脂肪性的组织，封闭在坚硬的骨髓腔内。分为红髓(造血细胞)和黄髓(脂肪细胞)两部分，正常成人骨髓重量为1600克3700克，约合体重的3.4%5.9%，其中红髓的重量约1000克。骨髓有复杂和丰富的血管系统。人的骨髓中主要靠营养动脉供应整个骨髓腔的毛细血管。骨髓的全部动脉都有神经束伴行，神经纤维来源于脊神经，和动脉共同自营养孔进入骨髓腔，与营养动脉平行分布于骨髓腔，并终止于动脉壁的平滑肌纤维。骨髓的血窦之间充满实质细胞，即造血细胞，骨髓造血多能干细胞向红系、粒系及巨核系的分化和造血微环境有关，造血微环境应可能由血管、巨噬细胞、神经及基质等组成。若从其功能考虑，造血微环境应包括影响造血作用的全部因素，其中血管因素是很重要的，因为各种造血物质及其刺激物质都要通过血管进入骨髓，才能造血。造血部位和血液循环之间存在屏障，即骨髓血液屏障，它具有控制血细胞进出骨髓的作用。(2)胸腺：出生后至老年，胸腺经历了一定的变化。到青春期后造血活动逐渐消失，为脂肪组织所代替。胸腺不但是胚胎时期的重要造血器官之一，而且出生后仍具有活跃的造血功能，特别在出生后两年内，腺体组织的生长较为迅速，造血活动也很旺盛。胸腺被结缔组织分隔成许多不完全的小叶。小叶的周围部分称皮质，中央部分称髓质。皮质充满密集的淋巴细胞，最浅层为较原始的淋巴细胞，中层为中等大小的淋巴细胞，深层为小淋巴细胞，从浅层到深层呈干细胞增殖分化成为胸腺依赖淋巴细胞(T细胞)的过程。成年胸腺虽然萎缩，但由于T细胞已在周围淋巴组织中定居，自己能够繁殖。胸腺除向周围淋巴组织输送T淋巴细胞外，还由上皮性网状分泌胸腺素，干细胞在胸腺激素的作用下，被诱导分化成熟为免疫活性T淋巴细胞。(3)脾脏：脾脏是人体最大的淋巴器官，其实质分为红髓和白髓两部分。白髓包括中央动脉周围淋巴鞘与脾小结。在中央动脉周围的是脾脏的胸腺依赖区，区内主要是T淋巴细胞。而脾小结即脾内的淋巴小结，小结内有生发中心，主要是B淋巴细胞。脾脏除能产生淋巴细胞及单核细胞以外，尚具有贮血和破坏衰老红细胞的功能。(4)阑尾及回肠的淋巴集结，骨髓的干细胞在此集结，能诱导增殖的干细胞分化为骨髓依赖淋巴细胞(B细胞)，并播散于周围淋巴器官中。(5)淋巴结：分为周围部分的皮质和中央部分的髓质。皮质浅层淋巴滤泡的中央为B细胞增殖的场所，称为生发中心或反应中心；皮质深层主要是由胸腺迁来的T细胞构成，称胸腺依赖区；在抗原的刺激下，T淋巴细胞可以增殖，产生大量致敏的小淋巴细胞，经血流直接作用于抗原。髓质主要由髓索(淋巴索)和淋巴窦构成。髓索的主要成分是B淋巴细胞、浆细胞及巨噬细胞等。 以上(2)、(3)、(4)、(5)部位属淋巴器官造血。淋巴器官，分为中枢淋巴器官和周围淋巴器官。胸腺及骨髓中的淋巴组织属中枢淋巴器官，为淋巴系定向干细胞聚焦的场所；淋巴结、脾脏及其它淋巴组织为周围淋巴器官，是分化了的T细胞及B细胞所在的场所。 (6)网状内皮系统(RES)：包括脾脏和淋巴结的网状细胞，覆盖在肝脏、骨髓、肾上腺皮质、脑垂体前叶的窦状隙上的内皮细胞以及其它器官内的游离组织细胞。其主要细胞成分为网状细胞，网状细胞能分化为吞噬性网状细胞。血中单核细胞，自髓生成后进入网状组织，则为组织细胞；在一定条件下，可转化为具吞噬功能的游离吞噬细胞，形成所谓的单核一巨噬细胞系统。 在正常情况下，出生2个月后的婴儿绝不会有骨髓外造血。在病理状态下，骨髓以外的组织官如脾、肝、淋巴结等都可出现造血灶，此即髓外造血，这是由于这些部位保留具有造血能力的间质细胞，恢复其胚胎时期的造血功能。 二、 造血微环境1. 骨髓微血管系统2. 骨髓神经3. 基质细胞及其分泌的调控因子第二节 造血细胞的生长发育和造血调控一、 造血细胞的生长发育造血细胞的生长发育包括增殖、分化、成熟和释放。过程见图：1-2 P9二、造血干细胞造血干细胞起源于人胚（受精后第2周末）的卵黄囊血岛；当胚体建立循环后，造血干细胞经血流迁入胚肝。第36月的胎儿肝是主要的造血器官，含造血干细胞较多，近年应用分离的胎肝造血细胞治疗再生障碍性贫血等血液病患者。出生后，造血干细胞主要存在于红骨髓，约占骨髓有核细胞的0.5，其次是脾和淋巴结，外周血中也有极少量。关于造血干细胞的形态结构，至今尚无定论，多数学者认为类似小淋巴细胞，直径79m，胞质内除大量游离核糖体和少量线粒体外，无其他细胞器。 造血干细胞的基本特性是：有很强潜能，在一定条件下能反复分裂，大量增殖；但在一般生理状态下，多数细胞处于G0期静止状态。有多向分化能力，在一些因素的作用下能分化形成不同的祖细胞。有自我复制能力，即细胞分裂后的子代细胞仍具原有特征，故造血干细胞可终身保持恒定的数量。造血祖细胞 由造血干细胞分化为几种不同的造血祖细胞，它们进而再分别分化为形态可辨认的各种幼稚血细胞。造血祖细胞的增殖能力有限，它们依靠造血干细胞的增殖来补充。造血祖细胞可用体外培养的细胞集落法测定。在不同的集落刺激因子（CSF）作用下，可分别出现不同的血细胞集落，目前已确认的造血祖细胞有：红细胞系造血祖细胞，必需在红细胞生成素（EPO，由肾等产生）作用下才能形成红细胞集落，又称红细胞集落生成单位（CFU-E）。中性粒细胞巨噬细胞系造血祖细胞，需在粒细胞生成素作用下形成该种细胞的集落，又称粒细胞巨噬细胞系集落生成单位（CFU-GM）。巨核细胞系造血祖细胞，需在血小板生成素作用下形成巨核细胞集落，又称巨核细胞系集落生成单位（CFU-M）。其在细胞的造血祖细胞的存在，目前尚无确切实验结果。三、造血调控（一）集落刺激因子 骨髓造血干细胞体外半固体培养技术的建立和重组集落刺激因子（CSF）的问世给集落刺激因子的研究提供了前提。根据细胞因子刺激不同造血细胞系或不同分化阶段的细胞在半固体培养基中形成不同细胞集落，分别命名为粒细胞CSF（G-CSF）、巨噬细胞CSF（M-CSF）、粒细胞和巨噬细胞CSF（GM-CSF）、多重集落刺激因子（multi-CSF,又称IL-3）、干细胞因子（SCF）、红细胞生成素（EPO）。有人将IL-5称为嗜酸性粒细胞集落刺激因子（Eo-CSF）。此外，IL-1、IL-6和IL-11在骨髓多能干细胞早期的分化中也有重要的作用。（二）白细胞介素 1.IL-3的产生主要由活化T细胞或T细胞克隆产生。小鼠髓样单核细系WEHI-3B细胞系可自发产生一定水平的IL-3。此外，胸腺上皮细胞、活化小鼠肥大细胞等也可表达IL-3。2.IL-3的分子结构和基因1984年美国和澳大利亚分别从ConA刺激小鼠T细胞和WEHI-3B细胞中提取高活性部分mRNA，逆转录成cDNA，进行克隆化和DNA序列分析。编码小鼠IL-3和GM-CSF的基因都定位于第11号染色体。IL-3的基因组由5个外显子和4个内含子组成。cDNA编码166氨基酸残基，N端26氨基酸残基为信号肽，此外N端另有数个氨基酸残基可能被血清蛋白酶所切除。成熟小鼠IL-3由131氨基酸残基组成，含有糖基，分子量为2528kDa（三）其他细胞因子第三节 造血干细胞体外培养技术 粒系红系祖细胞体外培养【参考值】粒系祖细胞体外琼脂培养：正常骨髓：细胞丛与集落数之比为520：1CFU-C约为5070/105有核细胞。正常外周血中CFU-C浓度约为骨髓的1/10。红系祖细胞体外血浆凝块培养：正常骨髓：CFU-E 为66/105有核细胞：BFU-E 为13/105有核细胞正常外周血：BFU-E 为238/105有核细胞集落的产率影响因素很多，各实验室报告均不一致，所以各实验室应建立自己的参考值。【临床意义】一般认为造血干细胞是一类特殊组织中的原始细胞，依靠这类细胞的增殖分化，而不是依靠机体的其它组织所提供的细胞来维持这类组织的功能和恒定的细胞群或恒定的细胞数量。从1961年发现脾结节生成的实验技术后，造血干细胞的研究得到了进一步发展。1965年以后又相继地出现了骨髓细胞体外琼脂培养等技术，为深入研究和认识造血干细胞的增殖和分化特性，以及造血干细胞群中多向性造血干细胞与各类定向祖细胞之间的相互关系提供了重要的研究手段。目前用于造血干细胞的研究方法主要有：脾结节测定法、体外琼脂培养法、体内扩散盒琼脂培养法，扩散盒造血干细胞测定法、促红细胞生成素（EP）反应细胞测定法，体外血浆凝块培养等。骨髓在体外琼脂培养中，当在培养体系中加入一定量的细胞团生成刺激因子或称集落刺激因子（Colony stimulation factor CSF）后，一般经过7天培养后，可以生成由粒细胞、单核巨噬细胞或两者混合组成的细胞团，在琼脂培养中每生成的一个细胞团称为一个细胞团生成单位（Colony forming unit-calture,CFU-C）。在琼脂培养中，50个以上细胞聚集在一起称为集落，3-49个细胞聚集在一起称为丛（Claster）。在醋酸地依红染色中，在低倍镜下见到集落有三种类型：致密型（Colse type）:主要由不同发育阶段的粒细胞系统的细胞组成。混合型（ Mixed type）：细胞团的中央为密集的粒细胞，周围环境疏散分布的单核巨噬细胞。 疏散型（Loose type）：主要由单核巨噬细胞组成。自从骨髓细胞在CSF作用下可以在体外琼脂培养体系中生成由粒细胞和单核巨噬细胞组成的细胞集落后，1971年发现造血细胞在体外血浆凝块培养中，在培养体系中加入适量促红细胞生成素（EP）的条件下，经过短期培养后生成了由红系细胞组成的细胞团或称集落，为了区别于粒细胞组成的细胞团（CFU-C或CFU-C）将红系细胞组成的细胞团称为CFU-E造血干细胞与临床血液疾患的关系极为密切，已有许多资料证明，大多数再生障碍性贫血是由于造血干细胞数量的减少或质量异常所致，少数可能由于造血环境或免疫异常引起。白血病则认为是干细胞的癌变，导致其分化与增殖失去平衡，增殖减慢，成熟受阻 。急性粒细胞性白血病患者，体外研究发现CFU-C增殖异常，特点是集落生成少或无，但有大量细胞丛生成，集落和丛由原始、幼稚和成熟缺陷的粒细胞组成。还有大量的残存的单个原始细胞散在琼脂中，在白血病治疗前呈“非白血病型生长（集落生成减低或不生长）”与呈“非白血病型生长（有小丛和大丛或残存原始细胞）”相比，前者的完全缓解率比后者为高。在诱导缓解期琼脂培养出现正常集落者，予示将会得到缓解。因此CFU-C体外琼脂培养对估计急性粒细胞白血病的预后和指导治疗具有一定意义。在对MDS研究中，发现多数造血组织增生征患者的血清和尿中CSF水平增高，如果出现“白血病型生长”集落，多数患者会在10个月内发生白血病。阵发性睡眠性血红蛋白症、真性红细胞增多症等也是造血干细胞异常的疾病，因此深入研究造血干细胞的生长特性及增殖分化的调节和控制已成为当前血液学研究中一个活跃领域。测定正常及各种血液疾患的骨髓和外周血中CFU-C、CFU-E、BFU-E等的变化可为血液疾患的治疗预后提供有用帮助，对于预测骨髓移植后的恢复状况，评价化疗药物对正常细胞的影响以及深入认识发病原理等都有一定的价值。第二章 正常血细胞形态学第一节 血细胞形态演变的一般规律血细胞的发生是一连续发展过程，各种血细胞的发育大致可分为三个阶段：原始阶段、幼稚阶段（又分早、中、晚三期）和成熟阶段。骨髓涂片检查，是血液病诊断的重要依据。血细胞发生过程中形态变化的一般规律如下：胞体由大变小，而巨核细胞的发生则由小变大。胞核由大变小，红细胞的核最后消失，粒细胞的核由圆形逐渐变成杆状乃至分叶，巨核细胞的核由小变大呈分叶状；核内染色质由细疏逐渐变粗密，核仁由明显渐至消失；核的着色由浅变深。胞质的量由少逐渐增多，胞质嗜碱性逐渐变弱，但单核细胞和淋巴细胞仍保持嗜碱性；胞质内的特殊结构如红细胞中的血红蛋白、粒细胞中的特殊颗粒均由无到有，并逐渐增多。细胞分裂能力从有到无，但淋巴细胞仍有很强的潜在分裂能力。1红细胞发生 红细胞发生历经原红细胞（Proerythroblast）、早幼红细胞（或称嗜碱性成红细胞,basophilic erthroblast）、中幼红细胞（或称多染性成红细胞，polychromatophilic erythroblast）、晚幼红细胞（或称正成红细胞,normoblast），后者脱去胞核成为网织红细胞，最终成为成熟红细胞。从原红细胞的发育至晚幼红细胞大约需34天。巨噬细胞可吞噬晚幼红细胞脱出的胞核和其他代谢产物，并为红细胞的发育提供铁质等营养物。红细胞发生过程的形态演变 发育阶段和名称胞体 大小 形状（m）胞核 形状 染色质 核仁核质比胞 质 嗜碱性 着色血红蛋白 分裂能力原始阶段 原红细胞 幼早幼红细胞稚 中幼红细胞阶 晚幼红细胞段成熟 网织红细胞阶 红细胞段1422 圆 1119 圆1014 圆912 圆79 圆盘状7 圆盘状圆 细粒状 23 34 圆粗粒状 偶见 12圆 粗块状 消失 约12圆 致密块 消失 更小无无强 墨水蓝 无 有 很强墨水蓝 开始出现 有减弱 嗜多染性 增多 弱 红蓝间染弱 红 大量 无 微 红 大量 无无 红 大量 无2粒细胞发生 粒细胞发生历经原粒细胞（myeloblast）、早幼粒细胞（又称前髓细胞，promyelocyte）、中幼粒细胞（又称髓细胞，myelocyte）、晚幼粒细胞（又称后髓细胞，metamyelocyte）进而分化为成熟的杆状核和分叶核粒细胞。从原粒细胞增殖分化为晚幼粒细胞大约需46天。骨髓内的杆核粒细胞和分叶核粒细胞的贮存量很大，在骨髓停留45天后释放入血。若骨髓加速释放，外周血中的粒细胞可骤然增多。各阶段细胞的一般形态特点见表52。 3单核细胞发生 单核细胞的发生经过原单核细胞（monoblast）和幼单核细胞(promonocyte)变为单核细胞。幼单核细胞增殖力很强，约38的幼单核细胞处于增殖状态，单核细胞在骨髓中的贮存量不及粒细胞多，当机体出现炎症或免疫功能活跃时，幼单核细胞加速分裂增殖，以提供足量的单核细胞。 4血小板发生 原巨核细胞（megakaryoblast）经幼巨核细胞（promegakaryocyte）发育为巨核细胞，巨核细胞的胞质块脱落成为血小板。原巨核细胞分化为幼巨核细胞，体积变大，胞核常呈肾形，胞质内出现细小颗粒。幼巨核细胞的核经数次分裂，但胞体不分裂，形成巨核细胞。巨核细胞呈不规则形，直径4070m，甚至更大，细胞核分叶状。胞质内有许多血小板颗粒，还有许多由滑面内质网形成的网状小管，将胞质分隔成许多小区，每个小区即是一个未来的血小板，内含颗粒。并可见到巨核细胞伸出细长的胞质突起沿着血窦壁伸入窦腔内，其胞质未端膨大脱落即成血小板。每个巨核细胞可生成约2000个血小板。 粒细胞发生过程的形态演变 发 育 阶段和名称胞体 大小 形状（m）胞 核 形状 染色质 核仁 核质 比例胞 质 嗜碱性 着色 嗜天青 特殊 分裂 颗粒 颗粒 能力原始阶段 原粒细胞 幼 早幼粒细胞稚 中幼粒细胞阶 晚幼粒细胞段成熟 杆状核粒细胞阶 分叶核粒细胞段1118 圆 1320 圆1116 圆1015 圆1015 圆1015 圆圆 细网状 26 34 卵圆 粗网状 偶见 12半圆 网块状 消失 约12肾形 网块状 消失 12带状 粗块状 消失 13分叶 粗块状 消失 更小强 天蓝 无 无 有 减弱淡蓝 大量 少量 有弱 浅蓝 少 增多 有极弱 浅红 少 明显 无消失 淡红 少 大量 无消失 淡红 少 大量 无5淋巴细胞发生 淋巴细胞的发生较复杂。淋巴细胞有多种亚群，它们既有发生育过程，又可因抗原刺激出现小淋巴细胞母细胞化和单株增殖过程，而且还缺乏常规光镜下可见的分化标志，故很难从形态上严格划分淋巴细胞的发生和分化阶段。以往的光镜形态观察，将淋巴细胞的发生传统地分为原淋巴细胞、幼淋巴细胞和淋巴细胞三个阶段，与近年免疫学研究结果尚无明确的关联第二节 各系血细胞的形态特征一、 粒细胞系1. 原粒细胞2. 早幼粒细胞3. 中幼粒细胞 （嗜酸、嗜碱）4. 晚幼粒细胞 （嗜酸、嗜碱）5. 杆状核粒细胞（嗜酸、嗜碱）6. 分叶核粒细胞（嗜酸、嗜碱）二、红细胞系1. 原红细胞2. 早幼红细胞3. 中幼红细胞4. 晚幼红细胞5. 网织红细胞6. 红细胞三、 巨核细胞系1. 原巨核细胞2. 幼稚巨核细胞3. 颗粒型巨核细胞4. 产板型巨核细胞5. 裸核型巨核细胞6. 血小板四、 淋巴细胞系1. 原淋巴细胞2. 幼淋巴细胞3. 淋巴细胞（大、小）五、 单核细胞系1. 原单核细胞2. 幼单核细胞3. 单核细胞4. 巨噬细胞六、 浆细胞系1. 原浆细胞2. 幼浆细胞3. 浆细胞七、 其他细胞1. 网状细胞2. 组织嗜碱细胞3. 内皮细胞4. 纤维细胞5. 成骨细胞6. 破骨细胞7. 脂肪细胞8. 退化细胞9. 分裂型细胞第三章 骨髓象检查第一节 概述一、适应症和禁忌症（一）确诊某些造血系统疾病（二）协助诊断部分血液系统疾病（三）提高某些疾病的诊断率二、标本的采集（一）骨髓取材的部位和方法（二）标本采集的质量控制（三）干抽三、骨髓涂片、染色及其质量保证第二节骨髓象检查的方法一、检查的步骤（一）骨髓涂片检查1.低倍镜检查 (1)判断标本是否满意 满意的骨髓涂片应薄厚适宜，细胞分布均匀、有核细胞着色清晰。 (2)判断骨髓增生程度 通常借助骨髓涂片中成熟红细胞与有核细胞之比来判断骨髓增生情况，并将其分为五级，见下表。 骨髓增生程度的分级 骨髓增生程度 成熟红细胞与有核细胞之比 常见原因 增生极度活跃 1:1 白血病、红白血病等 增生明显活跃 10:1 白血病、增生性贫血 增生活跃 20:1 正常骨髓或某些贫血 增生减低 50:1 造血功能低下 增生严重减低 300:1 典型的再生障碍性贫血 (3)估计巨核细胞系增生情况 于低倍镜下逐一视野浏览计数全部片膜内的巨核细胞数。 (4)注意涂片上、下两缘及片尾处有无体积较大或成堆出现的特殊细胞，如Gaucher细胞、Niemann-Pick细胞及转移癌细胞等。 2.油浸镜检查 选有核细胞丰富、分布均匀处，油镜下分类计数至少2 00个有核细胞，同时注意有无质的变化。 (1)计算粒系细胞总百分率及各阶段细胞所占百分率，并描述其细胞形态。 (2)计算红系细胞总百分率及各阶段细胞所占百分率，并描述其细胞形态。 (3)计算粒、红比值 粒细胞系各阶段细胞总和与红系各阶段细胞总和之比。 (4)分别计算淋巴细胞、单核细胞、浆细胞等的百分率。 (5)写出全片所见巨核细胞数。 (6)有无寄生虫及特殊细胞。 (7)描述成熟红细胞形态学。 (二)血涂片观察 1.低倍镜观察涂血染色是否满意。 2.油镜下分类计数至少100个白细胞，分别报告各类白细胞所占百分率，描述其形态染色情况及注意有无幼稚细胞出现。 3. 如外周血涂片出现幼红细胞则按分类100个白细胞过程中见到多少个来报告，并注明其属于何阶段。 4.描述成熟红细胞大小、形态、染色情况。 5.估计血小板数量并描述其形态大小和分布情况. 6.注意有无寄生虫。二、报告单的书写及资料存档 根据检验结果，按要求逐项详细填写并加以描述，综合骨髓象、血象所见结合临床资料提出具体意见供临床参考。 1.作出肯定性诊断 如骨髓、血象细胞学特征和临床表现均典型即可作出肯定性诊断.如各型白血病、巨幼细胞性贫血、多发性骨髓瘤、恶性组织细胞病、骨髓转移瘤等。 2.作出支持性诊断 如骨髓、血象改变可以解释临床表现时即可提出支持性意见.如支持缺铁性贫血、再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症等诊断。 3.作出排除性诊断 如骨髓、血象所见与临床诊断不符时可提出否定性意见以排除某些诊断。 4.骨髓、血象确有某些改变，但对临床表现提不出支持或否定性意见时，可描述其特点、并尽可能地提出进一步检查的建议供临床参考，必要时迫踪观察。 骨髓、血象报告单一式两份，其中一份发给临床，另一份随同骨髓检查申请单及检验标本一并存档妥善保存以供复查、总结、研究及教学使用。第三节 正常骨髓象由于正常骨髓内各细胞系及其各阶段百分率范围较大，因此凡分类符合下列情况者均可视为正常骨髓象。 1.骨髓增生活跃。 2.粒细胞系约占有核细胞的40%60%，其中原粒细胞2%，早幼粒细胞 5%、中、晚幼粒细胞各15%，杆状核粒细胞多于分叶核细胞，嗜酸粒细胞一般5%，嗜碱粒细胞1%，细胞大小、形态、染色基本正常。 3.幼红细胞总百分率约占有核细胞的20%左右，其中原红细胞1%，早幼红细胞5%，中、晚助红细胞约各占10%，细胞形态、染色基本正常。 4.粒、红比值 正常约为24:1。 5.淋巴细胞百分率约为20%(小儿可达40%)，均为成熟淋巴细胞。 6.单核细胞一般4%，浆细胞3%，均为成熟阶段者。 7.巨核细胞系通常于1.53cm2骨髓片膜上可见巨核细胞735个，多为成熟型。 8.可见少量网状细胞、内皮细胞、组织嗜碱细胞等。虽然它们各占百分率很低，但却均为骨髓成分的标志. 9.核分裂细胞不易见到，仅约为1。 10.成熟红细胞大小、形态、染色大致正常。 第四节 骨髓活检1. 骨髓活检的临床意义正确判断血细胞减少患者骨髓增生程度及其病因。判断骨髓的铁储存，尤其是怀疑储存铁降低或缺铁时，骨髓活检比骨髓涂片更有诊断价值。对于某些疾病（如再生障碍性贫血、缺铁性贫血及骨髓增生异常综合征）及化疗后骨髓抑制程度有明确诊断意义。可以发现骨髓穿刺涂片检查不易发现的病理性变化（如骨髓纤维化、骨髓坏死、胶样变性及肉芽肿等），对相关疾病的诊断和造血微环境及骨髓移植的研究有重要意义。对各种急、慢性白血病和骨髓增生异常综合征有确诊和化疗效果及判定预后的意义。对骨髓转移癌、恶性组织细胞病、戈谢病和尼曼-皮克病等诊断的阳性率比涂片高得多。可诊断慢性骨髓增生性疾病，如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化等。为明确“干抽”的原因，探讨究竟是真正的骨髓增生低下、骨髓纤维组织增生，还是髓腔因细胞增生极度活跃而致“干抽”引起，必须作骨髓活检明确诊断。2骨髓活检适应征多次骨髓穿刺取材失败。反复多部位骨髓穿刺为“干抽”，怀疑骨髓纤维化、骨髓转移癌、多发性骨髓瘤、多毛细胞白血病、某些急、慢性白血病及骨髓硬化症等的患者。血象显示全血细胞减少，反复骨髓穿刺均为“血液稀释”，或骨髓增生低下、病态造血，怀疑再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征及低增生性白血病的患者。某些贫血、原因不明的发热、脾或淋巴结肿大，骨髓涂片检查不能确诊者。凡需进行骨髓抽取物涂片检查的所有血液病、某些内科病、恶性肿瘤以及骨病患者。除血友病外，骨髓活检目前尚无绝对的禁忌症。即使在血小板减少症和其他许多出血性疾病中，进行此项操作也比较安全，一般没有明显出血。只要操作中注意严格消毒与适当的局部麻醉，必要时给予镇静与止痛剂，患者均能接受此项操作。3方法简介及质量保证方法：骨髓活检部位常选择髂后上棘和髂前上棘，病人的体位、局部消毒、穿刺技术基本与骨髓穿刺术相似。所不同之处骨髓活检选用活检穿刺针，以一定的方向旋转入骨皮质，活检针固定后，拔出连手柄针芯，套入长（或短）接柱，将针芯插入针座和针套管内，再以一定的方向旋转推进一定深度（约1cm），以一定方向转动几周，以一定方向旋转退针。将针管内的骨髓组织块（约入米粒大小），用针芯推出，放入装有10%甲醛液或95%酒精小瓶内，备切片用。质量保证同骨髓穿刺注意事项。开始进针不易太深，否则难以取出骨髓组织。穿刺活检时，一般不易吸取骨髓液涂片，因活检针管径较大（0.2mm）,易发生血液稀释。第五节 血细胞检验的临床应用评价一、结果的可靠性二、实验方法的评价实验：骨髓涂片染色及骨髓象分析方法实验准备一器材：载玻片盖玻片： 滴管：4个橡皮吸头：4个玻璃棒：4根烧杯：1000 ml，2个量筒：100ml、500 ml、1000 ml各一蜡笔棕色小口瓶碾钵载玻片处理：一般将载玻片先用洗衣粉水溶液煮沸20分钟，用流水冲洗，再经清洁液浸泡过夜，用流水反复冲洗，最后入95%酒精浸泡约1小时。取出，以洁净布巾夹持玻片边缘擦干备用。二试剂：瑞氏染液240ml 瑞氏染料粉剂 0.1g 纯甲醇（AR） 60ml将粉剂放入洁净干燥碾钵内，先加少量甲醇研磨使染料溶解，然后将已溶解的染料倒入洁净的棕色玻璃瓶内，剩下未溶解的再加入少量甲醇研磨，如此反复，直至染料完全溶解为止。新配制的染液需密封保存，室温放置1周后才能使用。染料存放越久，染色效果越好。磷酸盐缓冲液 1%KH2PO4 30ml 1%Na2HPO4 20ml加蒸馏水至800 ml，调PH值到6.57.0，定容至1000ml。甲醇二甲苯实验步骤一涂片（一）血液涂片的制作（1）需载玻片2张，分别称为玻片1和玻片2（推片）。（2）用玻片1一端接约3mm直径的血滴，将此玻片1保持水平。（3）取另一边缘平整的载玻片2（推片），将其前端放在血滴前，与片1保持30角并稍向后移与血滴接触，即见血液沿片2（推片）下缘散开，使血液展开并充满整个推片的宽度。（4）立刻将推片与载玻片呈30角，边轻压推片边将血液按下图的箭头方向推动涂抹，至血液铺完血膜为止。（5）挥动片1使血膜吹干，用蜡笔将血膜边缘圈画备染色。（6）每只动物涂片一张。（7）一张良好的血片，要求厚薄适宜，头、体、尾分明。（8）置30min1hr后较利于观察红细胞的形态。注意事项：l 如标本本身太短，可观察的部分会受局限，故以在离开载玻片另一端2cm地方涂抹为宜。l 载玻片、推片的角度越小、血液越薄；涂抹速度越慢、也越薄。在涂抹贫血病人的血液时，将推片稍竖起（不是30而是3540左右），以较快的速度推比较好，而对红细胞增高的病人则相反。l 如用力过猛白细胞容易破损。二染色（一）血液涂片的染色（1）将待染涂片平放于染色架上。（2）用滴管将染液滴于涂片上，覆盖整张涂片，放置13分钟。（3）加入等量的磷酸缓冲液或蒸馏水，与染液混匀，可以用滴管从一端吸入，另一端放出，混匀为止，或用嘴来回轻轻吹之，使之混匀，室温下染色510分钟（白细胞数多或骨髓标本时间应长一些，如2030min）。（4）染色结束时，先用蒸馏水或缓冲液洗将涂片上的染液直接冲掉。（5）再将片子用自来水温和冲洗，至血液膜呈淡红色。（6）甩干或晾干玻片。（7）封片。（二）骨髓涂片的染色同血液涂片。【染色原理】1瑞氏染料是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。美蓝（又名亚甲蓝mehyleme blue）为四甲基硫堇染料，通常为氯盐，即氯化美蓝。伊红（又名曙红eosin）通常为钠盐即伊红化钠。美蓝和伊红水溶液混合后产生一种憎液性胶体伊红化美蓝中性沉淀，即瑞氏染料。瑞氏染料溶于甲醇后重新解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。2细胞的染色既有物理性的吸附作用又有化学的亲和作用，各种细胞和细胞的各种成分化学性质不同对各种染料的亲和力也不一样，因此用染色液染色后在同一血片上可以看见不同的色彩。例如： 血红蛋白嗜酸性颗粒为碱性蛋白，与酸性染料伊红结合染成粉红色称为酸性物质。 细胞核蛋白和淋巴细胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染蓝色或紫色称为碱性物质。 中性颗粒成等电状态与伊红和美蓝均可结合，染紫红色称为中性物质。3PH对细胞染色的影响细胞各种成分均由蛋白质构成，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中正电荷增多易与伊红结合染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝，因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，在染色过程中玻片必须清洁，配制瑞氏染液必须用优质甲醇，稀释染液必须用缓冲液，冲洗水应近中性，否则各种细胞染色反应异常，致使细胞的识别困难，甚至造成错误。【血细胞发育规律】血细胞在分化成熟过程中，其形态和大小的变化基本上有一个共同的规律：1胞体：随着血细胞的发育成熟，胞体由大逐渐变小，但巨核细胞系统则由小变大，原始粒细胞至早幼粒细胞也逐渐由小变大。2胞核（1）大小：由大变小，但红细胞系统例外，成熟红细胞核消失。（2）形状：圆形变为不规则形；粒细胞核呈分叶状；淋巴与浆细胞系统变化不大。（3）染色质：细致、疏松逐渐变为粗糙、紧密。（4）核膜：不明显变为明显；原淋巴细胞核膜最厚；原幼粒细胞核膜最薄；原始单核细胞介于两者之间。（5）核仁：由有至无。清楚的核仁是原始和比较原始细胞的重要标记，呈淡蓝色，随着细胞的成熟而消失。3胞浆（1）量：有少到多。（2）颜色：深蓝到浅蓝，见于淋巴细胞与浆细胞。红细胞与粒细胞的胞浆各逐渐变成桔红和粉红色。（3）颗粒：一般从无到少并逐渐增多。粒细胞系统由少量的嗜天青颗粒逐渐代之以大量中性、嗜酸和嗜碱颗粒。（4）胞核与胞浆体积之比：由大到小。血涂片的观察方法1肉眼观察在观察染色标本时，首先用肉眼对颜色进行观察。如果是正常的末梢血液则呈粉红色，白血病时白细胞高度增加或骨髓瘤的高球蛋白血症等情况下，血涂片会带有蓝色（如下图1-4-1），此时应意识到为异常标本。2高倍镜下观察首先观察血涂片制备和染色是否良好、细胞分布是否均匀，同时可估计白细胞数量增减情况。最后对血涂片的体尾交界的区域进行观察，选择细胞分布均匀不重叠、标本不太厚容易观察的地方进行油镜观察（如图1-4-2）。3油镜下观察 边移动视野边观察下列各项：1）染色是否良好：如果血涂片染色确实不好，应重新染色。2）观察红细胞形态：（1）有无人为造成的变形，此外有时载玻片上的碱性物质的溶出（玻璃效应）会导致红细胞呈严重的棘形红细胞。如固定不良（固定液中含有水分时）会导致呈面包圈形红细胞，从而无法观察红细胞的形态。（2）大小如何，是大细胞还是小细胞，有无红细胞大小不一。（3）形态如何，注意有无畸形红细胞、球形红细胞、椭圆新红细胞、靶形红细胞、口形红细胞（唇形红细胞）、中心淡染色红细胞、棘形红细胞、胆状红细胞、皱缩红细胞、泪滴状红细胞、破碎红细胞及镰状红细胞等。（4）是否有染色性的变化，有无嗜多色性红细胞，中心淡染红细胞。（5）红细胞内有无异常。观察是否有嗜碱性点彩、豪-乔小体、卡波环状体红细胞、幼红细胞、帕彭海姆氏小体和疟原虫的出现。（6）有关大小不一，畸形和嗜多色性，可分为轻度、中度+、高度三个级别。3）观察白细胞形态（1）与红细胞比较，判断白细胞数是否正常，是否增加或减少。红细胞数/白细胞数约为500：1。（2）有关白细胞的种类，要观察大量的白细胞后才可判断是否异常，然后计算白细胞的百分率。在日常检查中，一般只计算100个，但是发现异常或白细胞有增加时，