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本本科科毕毕业业论论文文 不同厂家禽流感疫苗免疫效果比较 Compare the effects of several avian influenza vaccines from different companies 学 院 兽医学院 专 业 动物医学 姓 名 包 双 福 学 号 080110402 指导教师 祁 生 旺 职 称 副 教 授 论文完成日期 二 一二年六月 摘摘 要要 本试验采用辽宁益康 哈药广为 青岛易邦 肇庆大华农四家公司生产的禽流感 Re 4 株 Re 5 株二价灭活疫苗对大风公司大厂一场种鸡场的 220 只鸡进行分组免疫 试验鸡分别于免疫前 一免后 20d 30d 二免后 10d 60d 二免后 40d 进行采血 用血凝和血凝抑制试验检测免疫抗体水平 结果表明 四个厂家禽流感 Re 4 株 Re 5 株二价灭活疫苗免疫后均未出现疫苗反应 总体免疫合格率均高于国家标准 关键词 禽流感 疫苗 免疫效果 Abstract In this experiment 220 chickens were divided into several groups and immunized with avian influenza vaccines produced by Liaoning yikang Hayao guangwei Qingdao yibang and ZhaoqingDahua nongsheng respectively Serum were collected at 20d 30d and 60d post immunization and the swine fever virus antibodies were detected by test Results showed that the four kinds of vaccines are safety no side affect was observed during the immunization time and the passing rate of the four vaccines are higher that the national standards Key words Avian influenza Vaccine Immunization 目 录 1 前言 1 1 1 病原 1 1 1 1 流感病毒的分类 1 1 1 2 流感病毒的形态 1 1 1 3 流感病毒的抗原型 1 1 2 流行病学 1 1 3 临床症状 2 1 4 病理变化 2 1 5 诊断 2 1 5 1 临诊诊断 2 1 5 2 鉴别诊断 2 1 5 3 实验室诊断 2 1 6 目前的防制措施 3 1 6 1 平时的预防措施 3 1 6 2 发病时的紧急措施 3 1 7 常用疫苗 3 1 8 本研究的目的与意义 3 2 材料与方法 4 2 1 材料 4 2 1 1 试验动物 4 2 1 2 禽流感疫苗 4 2 1 3 器材药品准备 4 2 1 4 HA 和 HI 试验用溶液的配制 5 2 2 试验方法 5 2 2 1 鸡的分组与免疫 5 2 2 2 抗体检测 5 2 2 3 试验步骤 5 3 结果 6 3 1 疫苗免疫反应结果 6 3 2 不同厂家禽流感疫苗免疫后抗体检测结果 7 4 讨论与小结 7 4 1 讨论 7 4 2 小结 8 4 3 建议及注意 8 参 考 文 献 8 致 谢 9 内蒙古农业大学学士学位论文 1 1 前言 禽流感 Avian Influenza AI 又称欧洲鸡瘟 真性鸡瘟 是由正粘病毒科 流感病毒属 A 型流感病毒引起的禽类感染和 或疾病综合症 现在在全世界各种家 禽和野生禽类中 已发现了上千种属于不同抗原亚型的流感病毒 更为甚者是在短 短的几年时间里 先后发生禽流感 H5N1 H7N7 H9N2 病毒跨越种属屏障直接感染人 类的病例 引起世界各地流感专家们的高度关注 虽然目前还没有发现禽流感 H5N1 H7N7 H9N2 病毒具有人传人的能力 但它们均属甲型流感病毒 而甲型流感 病毒变异性非常大 就有可能通过抗原变异或通过与人流感病毒发生基因重配 形 成重配株 从而具备人传人的能力 因此 禽流感给人类带来了严峻的挑战 它具 有极其重要的公共卫生意义 1 1 病原 1 1 1 流感病毒的分类 禽流感的病原为禽流感病毒 分类属于正粘病毒科 根据病原核蛋白 NP 和膜蛋白 MP 抗原及其基因特性的不同将流感病毒分为A B C 三型 A 型流感病毒可引起人和动物发生流感 常以流行形式出现 引起世界性流感大 流行 在动物中广泛存在 也可能引起大批动物死亡 B 型和 C 型流感病毒主要 引起人发生流感 1 1 2 流感病毒的形态 流感病毒呈多形性丝状或球状 直径 80 120nm 核衣壳为螺旋对称 核酸 类型为单股负链 RNA 其 RNA 链由 8 个节段构成 病毒粒子外有囊膜 囊膜上有 呈辐射状排列的两种纤突 一是血凝素 HA 另一是神经氨酸酶 NA 是流感 病毒主要的表面抗原 1 1 3 流感病毒的抗原型 A 型流感病毒根据血凝素 H 和神经氨酸酶 N 结构不同分成许多亚型 血凝 素 H 有 15 个亚型 H1 H15 神经氨酸酶 N 有 9 个亚型 N1 N9 它们之间 的不同组合 使 A 型流感病毒有许多亚型 如 H1N1 H2N2 H2N1 H1N2 等 理论上可产生不同的 135 种病毒亚型 各亚型之间无交互免疫力 1 2 流行病学 传染源主要为患禽流感或携带禽流感病毒的家禽 另外野禽或猪也可成为 传染源 许多家禽都可感染病毒发病 活鸡 鸡 鸽子 珍珠鸡 鹌鹑 鹦鹉等 陆禽都可感染发病 但以 活鸡和鸡最为易感 发病率和死亡率都很高 鸭和鹅等 水禽也易感染 并可带毒或隐性感染 有时也会大量死亡 各种日龄的鸡和活 鸡都可感染发病死亡 而对于水禽如雏鸭 雏鹅其死亡率较高 发病季节 禽 流感一年四季均可发生 但多爆发于冬 春季节 尤其是秋冬 冬春之交 气候 变化大的时期 一般情况下夏季发病较少 多是零星发生 发病鸡群的症状也较 轻 传染途径 禽流感主演通过横向转播 即通过易感禽类直接接触或与病毒污 染物 如被污染的饮食 飞沫 饲料及其他被污染的筐 蛋盘 运输工具等 病 毒污染的羽毛和粪便是主要传染物 因为病毒含量高而且存活时间长 应特别注 意 1 3 临床症状 各种日龄和品种的鸡均可发病 潜伏期短 病鸡发病急 舍内传播迅速 但传 播范围往往不大 流行初期的急性病例 可不出现任何症状而死亡 病鸡表现为 体温升高 羽毛逆立 头脸部水肿 流泪 分泌物增多 冠及肉髯肿胀 边缘出血 2 不同厂家禽流感疫苗免疫效果比较 坏死呈紫黑色 伴有不同程度的呼吸系统疾病症状 出现或不出现下痢 下痢以黄 绿色 绿色 稀便为主 后趾趾部鳞片有紫黑色出血 产蛋量明显下降 病鸡震颤 扭颈 1 4 病理变化 最急性死亡的病鸡常无眼观变化 急性者可见头部和颜面浮肿 鸡冠 肉髯肿 大达 3 倍以上 皮下有黄色胶样浸润 出血 胸 腹部脂肪有紫红色出血斑 心包 积水 心外膜有点状或条纹状坏死 心肌软化 病鸡腿部肌肉出血 有出血点或出血 斑 消化道变化表现为腺胃乳头水肿 出血 肌胃角质层下出血 肌胃与腺胃交界 处呈带状或环状出血 十二指肠 盲肠扁桃体 泄殖腔充血 出血 肝 脾 肾脏 瘀血肿大 有白色小块坏死 呼吸道有大量炎性分泌物或黄白色干酪样坏死 胸腺 萎缩 有程度不同的点 斑状出血 法氏囊萎缩或呈黄色水肿 有充血 出血 母 鸡卵泡充血 出血 卵黄液变稀薄 严重者卵泡破裂 卵黄散落到腹腔中 形成卵 黄性腹膜炎 腹腔中充满稀薄的卵黄 输卵管水肿 充血 内有浆液性 粘液性或 干酪样物质 公鸡睾丸变性坏死 1 5 诊断 1 5 1 临诊诊断 根据本病的流行病学 临诊症状和病理变化可作出初步诊断 1 5 2 鉴别诊断 应与鸡新城疫 禽霍乱 传染性支气管炎 传染性喉气管炎等病作鉴别诊断 1 5 3 实验室诊断 确诊应进行实验室诊断 从病毒分离 血清抗体 病毒抗原检测等方面进行检测 1 病毒分离 在发热初期采取呼吸道分泌物 或用灭菌棉棒擦拭鼻咽部分泌 物 泄殖腔 发病动物的实质脏器 经常规方法处理后 接种于 9 11 天的鸡胚尿 囊腔内 培养 5 天后 取尿囊液作血凝试验 阳性则证明有病毒繁殖 再以此材料 作补体结合试验 决定型 和血凝抑制试验 决定亚型 进行病毒鉴定 2 血清抗体检测 用血凝抑制试验 琼脂扩散试验 ELISA 斑点法 ELISA 补体结合试验 中和试验等 3 病毒抗原检测 取病鸡组织制成切片或涂片 用荧光抗体法或酶标组化法 检测病料组织中的病毒抗原 4 分子生物学诊断方法 RT PCR 方法检测禽流感病毒 4 小时检出结果 H5 型禽 流感病毒检测箱采用基因方法 5 小时测出病毒基因 也可核酸探针技术进行检测 禽流感病毒 1 6 目前的防制措施 1 6 1 平时的预防措施 1 无病地区 应加强检疫 禁止从发病地区输入可能为病毒潜在来源的动物 及未经无害化处理的畜产品 2 避免鸡群与野鸟 水禽 海鸟接触 建立鸡场应远离迁徙性水禽 海鸟的 水源地 3 加强兽医卫生管理措施 无关人员不得进出养禽场 人员进出养禽场应消 毒 内蒙古农业大学学士学位论文 3 4 免疫预防 使用与当地流行毒株毒型相同的疫苗进行免疫接种 我国现有 H5 H7 H9 亚型的灭活苗 如果病毒亚型相同 效果良好 1 6 2 发病时的紧急措施 1 发生本病时 及时发现 上报疫情 封锁疫区 并通知邻近地区做好防疫工 作 2 消灭传染源 扑杀疫区内所有易感动物 焚烧或掩埋禽类尸体及污染物 3 切断传播途经 彻底消毒污染的禽舍 环境 停止易感动物流通 进出疫 区要消毒 4 紧急免疫接种 使用与当地流行毒株毒型相同的疫苗进行免疫接种 建立 免疫带 5 疫区内最后一只病禽消失后 21 天内 无新病例发生 进行彻底的终末消毒 解除封锁 1 7 常用疫苗 禽流感 H5 H9 二价灭活疫苗 H5H1 Re 1 H9N2 Re 2 株 蛋鸡和种鸡等 家禽须分别免疫 H5N1 和 H9N2 亚型禽流感灭 活疫苗 该疫苗的禽流感病毒 H5N1 亚型 Re 1 株和 H9N2 亚型 Re 2 株种毒都是人工重组构建的 种毒的效价高 针 对性强 疫苗免疫效果好 重组禽流感病毒H5 亚型二价灭活疫苗 H5N1 Re 5 株 Re 4 株 疫苗中含灭活的重组禽流感病毒 H5N1 亚型 Re 5 株 灭活前 Re 5 株鸡胚液 HA 效价 9log2 Re 4 株鸡胚液 HA 效价 8log2 乳白色乳剂 用于 预防由 H5 亚型禽流感病毒引起的禽流感 胸部肌肉或颈部皮下注射 2 5 周 龄鸡 每只 0 3 ml 5 周龄以上鸡 每只 0 5 ml 一般无可见的不良反应 宁夏 山西 陕西 河南 河北 山东 北京 天津 内蒙古 辽宁 江苏 浙江 上 海 安徽受变异毒株威胁区使用重组禽流感病毒H5 亚型二价灭活疫苗 H5N1 Re 5 Re 4 株 或选择使用禽流感灭活疫苗 H5N1 Re 5 株 禽流 感灭活疫苗 H5N1 Re 4 株 进行免疫 水禽使用禽流感灭活疫苗 H5N1 Re 5 株 进行免疫 其他地区根据检测情况 可使用变异毒株疫苗进行 免疫 报兽医局备案 1 8 本研究的目的与意义 我国于 1994 年首次在广东省的发病鸡群中分离到禽流感病毒 其后在 20 多个 省市的鸡群和鸭群中流行并引起发病 给养禽业造成了巨大的经济损失 H5N1 亚型 禽流感的暴发给世界养禽业造成毁灭性打击 而且具有重要的公共卫生学意义 自 2003 年年底韩国首次暴发高致病性禽流感以来 2004 年 1 月 疫情迅速在东 亚 东南亚和南亚地区蔓延 韩国 越南 日本 中国台湾 泰国 柬埔寨 印度 尼西亚 中国香港 巴基斯坦 中国和老挝相继报告发生高禽流感 除中国台湾省 为 H5N2 型 巴基斯坦为 H7 型低致病性禽流感以外 其余国家和地区均为 H5N1 型 高致病性禽流感 截至 2004 年 10 月 4 日 越南和泰国共发现人禽流感患者 43 例 其 中 31 例死亡 2004 年 中国大陆发生疫情后 中国政府高度重视 采取了对疫区周边受威 胁区 边境地区家禽进行紧急免疫 扑杀疫区内所有家禽等防控措施 有效控制了 疫情 疫区人民生产生活秩序良好 目前 中国实施积极的禽流感免疫政策 对全 国所有家禽 包括种用 蛋用 肉用的鸡 鸭 鹅 家禽以及饲养的鸽子 鹌鹑 鸵鸟 雉鸡等进行强制免疫 对防疫条件好 进口国有要求的出口企业及提供研究 4 不同厂家禽流感疫苗免疫效果比较 和疫苗生产用途的家禽 经中国省级兽医行政管理部门批准 可以不进行免疫 中 国没有对野禽进行禽流感免疫 2006 年 1 9 月 中国内地免疫家禽 82 亿羽 根据 当前全球和国内禽流感形势 中国将继续实行高致病性禽流感全面免疫政策 近几年国内普遍流行禽流感 主要防控措施是强制免疫 目前有很多种禽流感 疫苗 为了做多种疫苗的免疫效果比较 我们用来自不同厂家的四个疫苗来免疫 然后用血凝和血凝抑制试验检测抗体效价 从而选出免疫效果较好 适合当地使用 的疫苗进行免疫接种防止禽流感的流行 本人在大风公司实习期间参与这一研究工 作 现将研究结果报告如下 2 材料与方法 2 1材料 2 1 1试验动物 20 25 日龄鸡 220 只 由大风公司大厂一场种鸡场提供 将试验鸡随机分为五 组 1 4 为试验组 每组 50 只鸡 第五组为对照组 20 只鸡 2 1 2禽流感疫苗 辽宁益康生物制品有限公司重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗 H5N1 Re 5 株 Re 4株 批号2110104 哈药集团广为生物疫苗有限公司重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗 H5N1 Re 5株 Re 4株 批号201041 肇庆大华农生物药品有限公司重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗 H5N1 Re 5株 Re 4株 批号 010327 青岛易邦生物工程有限公司 禽流感 H5N1 Re 5株 Re 4株 二价灭活疫苗 批 号2010100 2 1 3器材药品准备 96 孔 V 型微量反应板 微量移液器 配有滴头 阿氏 Alsevers 液 1 鸡 红细胞悬液 配制方法见附录 pH7 2 0 01mol L PBS 高致病性禽流感病毒血 凝分型抗原和标准分型血清以及阴性血清等由内蒙古动物疫病预防控制中心提供 2 1 4 HA 和 HI 试验用溶液的配制 1 阿氏 Alsevers 液配制 葡萄糖 2 05g 柠檬酸钠 0 8g 柠檬酸 0 055g 氯化钠 0 42g 加蒸馏水至 100mL 散热溶解后调 pH 值至 6 1 69kPa 15min 高压灭菌 4 保存备用 2 1 鸡红细胞悬液制备 采集至少 3 只 SPF 公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体 积阿氏液混合 用 pH7 2 0 01mol PBS 液洗涤 3 次 每次均以 1000r min 离心 10min 洗涤后用 PBS 配成体积分数为 1 红细胞悬液 4 保存备用 3 PBS 配制方法 2 2试验方法 2 2 1鸡的分组与免疫 内蒙古农业大学学士学位论文 5 试验组分成 5 组 试验一组为辽宁益康疫苗免疫 50 只 试验二组用哈药广疫苗 免疫 50 只 疫苗免疫 50 只 第三组为青岛易邦疫苗免疫 50 只 第四组为肇庆大华农的疫苗免 疫 50 只 第五组为空白对照组 20 只 对疫苗组试验动物分别按照疫苗说明书剂量 进行免疫注射 一免后 20d 补免 采血分离血清监测抗体效价 2 2 2 抗体检测 2 2 2 1 采血与分离血清 试验鸡分别于免疫前 一免后 20d 30d 二免后 10d 60d 二免后 40d 从 5 组鸡随机抓 10 只的翅静脉采血并进行分离血清 2 2 2 2 抗体检测 用血凝和血凝抑制试验检测抗体效价 2 2 3 试验步骤 血凝 HA 试验 微量法 1 在微量反应板的 1 孔 12 孔均加入 0 025mL PBS 2 吸取 0 025mL 病毒悬液 如感染性鸡胚尿囊液 加入第 1 孔 混匀 3 从第 1 孔吸取 0 025mL 病毒液加入第 2 孔 混匀后吸取 0 025mL 加入第 3 孔 如此进行对倍稀释至第 11 孔 从第 11 孔吸取 0 025mL 弃之 换滴头 4 每孔再加入 0 025mL PBS 5 每孔均加入 0 025mL 体积分数为 1 鸡红细胞悬液 将鸡红细胞悬液充分 摇匀后加入 6 振荡混匀 在室温 20 25 下静置 40min 后观察结果 如果环境温 度太高 可置 4 环境下 对照孔红细胞将成明显的纽扣状沉到孔底 7 结果判定 将板倾斜 观察红细胞有无呈泪滴状流淌 完全血凝 不流淌 的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位 HAU 血凝抑制 HI 试验 微量法 1 根据 1 2 1 试验结果配置 4HAU 的病毒抗原 以完全血凝的病毒最高倍数 作为终点 终点稀释倍数除以 4 即为含 4HAU 的抗原的稀释倍数 例如 如果血凝 的终点滴度为 1 256 则 4HAU 抗原的稀释倍数应是 1 64 256 除以 4 2 在微量反应板的 1 孔 11 孔加入 0 025mL PBS 第 12 孔加入 0 05mL PBS 3 吸取 0 025mL 血清加入第 1 孔内 充分混匀后吸取 0 025mL 于第 2 孔 依次对倍稀释至第 10 孔 从第 10 孔吸取 0 025mL 弃去 4 1 孔 11 孔均加入 4HAU 混匀的病毒抗原液 0 025mL 室温 约 20 静 置至少 30min 5 每孔加入 0 025mL 体积分数为 1 的鸡红细胞悬液混匀 轻轻混匀 静 置约 40min 室温约 20 如环境温度太高可置 4 条件下进行 对照红细胞将 呈现纽扣状沉于孔底 6 结果判定 以完全抑制 4 个 HAU 抗原的血清最高稀释倍数作为 HI 滴度 只有阴性对照孔血清滴度不大于 2 2 阳性对照孔血清误差不超过 1 个滴度 试验结果才有效 HI 价小于或等于 3 2判定 HI 试验阴性 HI 价等于 4 2为可疑 需重复试验 HI 价大于或等于 5 2为阳性 3 结果 6 不同厂家禽流感疫苗免疫效果比较 3 1疫苗免疫反应结果 经试验鸡临床免疫 共计免疫鸡 220 只 无其它不良反应 未出现死亡现象 不同厂家禽流感疫苗免疫后 Re 4 株抗体效价结果如表 1 不同厂家禽流感疫苗免疫后 Re 5 株抗体效价结果如表 2 表 1 不同厂家禽流感疫苗免疫后 Re 4 株抗体效价 log2 免疫前 20d30d60d 哈药 0888 青岛 07 97 87 5 大华农 087 57 辽宁 07 97 26 4 对照 0000 表 2 不同厂家禽流感疫苗免疫后 Re 5 株抗体效价 log2 免疫前 20d30d60d 哈药 0888 青岛 087 47 大华农 087 16 8 辽宁 07 76 75 4 对照 0000 3 2 不同厂家禽流感疫苗免疫后抗体检测结果 不同厂家禽流感疫苗免疫后 Re 4 株抗体效价和抗体消长情况结果如图 1 不同厂家禽流感疫苗免疫后 Re 5 株抗体效价和抗体消长情况结果如图 2 表1 不同厂家禽流感疫苗免疫后Re 4株抗体效价 log2 0 2 4 6 8 10 免疫前20d30d 60d 哈药青岛大华农辽宁对照 图 1 不同厂家禽流感疫苗免疫后 Re 4 株抗体消长情况 内蒙古农业大学学士学位论文 7 H5亚型禽流感 Re 5株 免疫抗体消长情况 0 2 4 6 8 10 免疫前20d30d60d 哈药青岛大华农辽宁对照 图 2 不同厂家禽流感疫苗免疫后 Re 5 株抗体消长情况 4 讨论与小结 4 1 讨论 四个不同厂家生产的禽流感二价灭活疫苗免疫鸡均无引起不良免疫反应 四个 厂家的禽流感疫苗免疫后 20d 60d 均能达到很高的免疫抗体水平 但是辽宁益康生 产的禽流感二价灭活疫苗免疫总体抗体水平略低于其它三个厂家 4 2 小结 辽宁益康组免疫鸡禽流感母源 Re 4 株及 Re 5 株抗体均为零 20d 30d Re 4 株和 Re 5 株抗体全部达到 1 128 以上 60d Re 4 株抗体有所下降 全部抗体均达 到 1 16 以上 效价从 1 16 到 1 128 均有 Re 5 株抗体也有所下降 全部抗体均达 到 1 16 以上 哈药广为疫苗组免疫鸡禽流感母源 Re 4 株及 Re 5 株抗体均为零 20d 30d 和 60d Re 4 株和 Re 5 株抗体均达到 1 128 以上 青岛易邦疫苗组免疫鸡 禽流感母源 Re 4 株及 Re 5 株抗体均为零 20d 30d 和 60d Re 4 株和 Re 5 株抗体 抗体均达到 1 128 以上 肇庆大华农疫苗组免疫鸡禽流感母源 Re 4 株及 Re 5 株抗 体均为零 20d 30d 和 60d Re 4 株和 Re 5 株抗体均达到 1 128 以上 说明四个 不同厂家生产的口蹄疫疫苗免疫效果不一样 其中辽宁益康疫苗免疫效果最差 4 3 建议及注意 为了准确进行免疫效果监测应注意一下几点 合理选择抗原和对照阳性血 清 针对 Re 1 和 Re 4 株疫苗免疫采用抗原和对照阳性血清 同一亚型的禽流感 病毒制成的抗原 如果毒株来源不同 则可能会存在抗原性差异 从而使检测同 一血清的结果有差别 一般来讲 免疫种毒株如果与抗原所用毒株相同时 则所 测得 HI 效价较高 合理使用和保存抗原 反应试剂按规定保存和使用 冻干 的试剂应按照说明中规定的体积重新溶解并保存 要避免杂菌污染 因为污染所 造成的非流感起源的凝集素也可与所有抗血清发生非特异反应 为避免反复冻融 和细菌污染 要无菌操作将试剂分装成小包装 反应温度应控制在 15 30 之间 太高或太低均会影响检测结果 掌握好孵育时间 本操作中 HA 和 HI 试验中加入红细胞后的作用时间均为 40min 主要是参照 OIE 标准 在一些病毒 株中可见红细胞从病毒中解脱 如果有这种情况发生 要提前判定 约 8 不同厂家禽流感疫苗免疫效果比较 25 30min 或 4 下孵育 一般来讲 主要看红细胞对照孔 对照完全沉淀时要 迅速判读 标准抗原稀释浓度必须为 4 个 HA 单位 25 L 必须每天制备并在 试验前滴定 红细胞悬液要始终符合标准 使用时应随时振荡 稀释液应 选用 PBS 反应体系为 0 075ml 每次试验时均应设阳性血清对照 阳性对照 孔血清误差不超过 1 个滴度 试验结果才有效 标准阳性血清的HI 效价可由本 实验室判定 具体操作可在购进一批抗原和标准阳性血清以后 取几瓶血清 溶 解到一起 分成小包装 70 无条件者可用 20 保存备用 每次用时取 一小管 取冻存血清 1 支 由几个操作人或分几次 红细胞等最好是分别配制 测定阳性血清效价 取平均值作为最终的标准阳性血清效价 大量检测时不需每 板均做阳性对照 一般可在试验前 中 后分别设阳性血清 内蒙古农业大学学士学位论文 9 参 考 文 献 1甘孟侯 中国禽病学 M 北京 中国农业出版社 1999 2戚中田 禽流感病毒与人类禽流感 J 中国科学基金 2004 18 2 68 71 3陈化兰 于康震 田国滨 等 DNA 免疫诱导鸡对禽流感病毒的免疫保护反应 J 中 国农业科学 1998 31 5 63 68 4霍惠玲 王增利 高丰 等 禽流感疫苗研究进展 J 动物医