流式细胞仪分选仪工作原理

流式细胞分选仪工作原理 陈邦chen B 内容 流式的概念流式的分析原理流式数据解读影响流式检测的因素流式分选工作原理 流式的概念 细胞术检测经典方法 荧光显微镜 激光共聚焦 优点 样本兼容性强 定性分析缺点 分析速度慢 参数少 难以定量 流式细胞仪概念图 流式细胞仪通过检测器接收激光照射液流内细胞 或颗粒 产生的光信号 经过光电转换和统计分析 从而反映细胞物理化学特征和细胞功能 流式细胞术的特点 单细胞分析分析速度快多参数标记结果客观 流式的检测对象 细胞 微藻 细菌 染色体 单个的生物颗粒 可溶性细胞因子等 流式细胞仪的检测内容 细胞结构细胞大小细胞内粒度度DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量 细胞功能细胞表面 胞浆 核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性细胞受体 流式分析原理 流式细胞仪构造 液流系统 承载细胞快速流动形成单细胞流 流体动力聚焦 光学系统 激光 信号激发滤光片 光信号传递检测器 信号接收 光信号检测 自发荧光转染荧光标记 荧光信号 前向散射光 FS 侧向散射光 SS 散射光信号 散射光信号由细胞 颗粒 本身及其内容物对激光的折射产生 主要反映了细胞 颗粒 的物理特征如大小或内部复杂程度 散射光信号 散射光信号 前向散射光 FS 侧向散射光 SS 反映细胞大小 反映细胞内部复杂程度 前向散射光 前向散射光 FS 信号的反映细胞的大小 侧向散射光 侧向散射光 SS 信号的反映细胞的颗粒度 可以根据细胞的大小和颗粒度这两个基本特征 对细胞进行初步的分群和分类 FS SS散点图 荧光信号 细胞受体 分子核酸 DNA RNA 蛋白酶染色体基因表达离子浓度 细胞自身萤光或使用荧光染料 荧光抗体标记 对细胞的生物 化学指标进行检测 1 抗原抗体结合 如表型测定 比如CD3 FITC 2 荧光素特异性结合 如周期测定 比如PI测定细胞周期 3 生物大分子之间的结合 如PS与ANNEXINV的结合 凋亡测定 4 通过相互作用引入荧光 FRET 5 通过代谢不同对目标进行识别 SP染色 6 通过电势能结合 膜电位测定 让目标特异性带上荧光 激光器和荧光检测器的数目越多 选择越广激光功率越大 激发效果越好 荧光素选择 电子系统 光电转换 数据处理 光电转换 Area Lin面积High Peak峰高Width峰宽 Log 对数 Lin 线性 流式分析流程 荧光素 抗体 细胞 流式数据解读 流式图的解读 单参数 直方图 X轴表示荧光强度Y轴表示频数 双参数 散点图 X轴与Y轴均表示荧光强度一个点表示一个细胞 提供信息 流式的结果图例 百分比 目标细胞占选定细胞群或所有细胞的比例绝对数 目标细胞的浓度荧光强度 单个目标细胞上表达某种荧光素的多少细胞相对大小 单参数 直方图 双参数 散点图 影响流式检测的因素 样本制备 单细胞悬液的制备 物理法 酶解法标本完整性 有无严重溶血或凝血 抗凝剂选择 EDTA 12 24h 肝素 48 72h 样本洗涤 washorno wash 样本浓度细胞活率染色步骤 胞外 胞内 影响流式结果的参数设置 阈值 触发信号 Threshold Triger 电压 Voltage 增益 Gain 荧光干扰 补偿Compensate 圈门 设门 Gate 统计 Statistics 阈值 触发信号 Threshold Triger 数据采集的前提条件所选择的信号被称为阈值或触发信号阈值可以量化 大于该阈值的细胞信号才会被收集 以排除不必要杂质的干扰 电压 增益 目的 调节检测器的信号扩增程度 信号随着电压或增益的增加而增强 作用 通过电压及增益的调节区分信号强弱不同的细胞 电压 增益增加 信号变强 反之 信号变弱 电压调节阴性对照 同型对照 空白对照 以阴性群完全出现 以正态分布为标准 调节电压使阴性对照的本底荧光处于比较低的水平 荧光干扰 补偿Compensate 当细胞携带两种或两种以上的荧光素时 受到激光激发会发射出两种或以上波长的荧光 由于目前所使用的荧光染料发射谱较宽 虽然他们之间各自发射峰值各不相同 弹发射谱范围有一定的重叠 会对其他通道上的数值产生影响 SILENT UNTOUCHABLE UNTOUCHABLE Untouchable 其他染料没有干扰 cleanrow Silent 不会漏进其他通道 cleancolumn 补偿矩阵 补偿调节单染管 表达单一荧光的样本 一定要使用阳性组 或阳性处理组 只有阴性群的样本无法调节电压 可以使用VeserComp一类的自动捕获抗体微球代替 荧光补偿 Compensate FITC单染 荧光补偿 Compensate PE单染 验证 圈门 设门 Gate 圈门是在流式图中根据需要圈定一群细胞 设门是将门内的细胞应用在其他图中进行进一步的分析 门的种类很多 包括水平门 十字门 铰链门 多边形们 矩形门 椭圆型门等等 圈门 设门 Gate 流式分选 基于免疫荧光的单细胞分选 流式分选过程 影响分选的因素 细胞状态 细胞浓度 粘附性 样本处理 染色 对照 仪器条件 液滴形成 DropDelay检测 断点维持 分选操作 分选模式 阈值 设门 实验样品的准备 样品浓度 建议在1 10 x106cells ml为避免样品聚集成团 上样前应用200目筛网过滤粘附性强的细胞可考虑在培养液或PBS里加入BSA或EDTA死细胞过多考虑应用PI 7 AAD等染料排除 仪器设置 液滴形成 液滴形成的要素 喷嘴振荡频率压力 喷嘴选择 不同的细胞大小和细胞特性 理应选择不同规格的喷嘴头 建议 细胞应约为喷嘴直径的1 3 1 4 MoFloXDP 50 染色体 亚细胞结构 70 80 90 100 120 150 200 m 大型真菌 原生质体 液滴形成率与分选速度 震荡频率 3倍细胞流速是高分选效率的保证 频率和振幅的调节 液滴规则 断点清晰 间隔明显 DropDelay检测和维持 延迟时间 影响分选纯度断点位置 因此液滴延迟