《益生菌与益生素》PPT课件.ppt

益生素与益生菌 南昌大学中德联合研究院曹郁生 主要内容 1 简介2 肠道菌群和营养代谢3 益生菌的功能4 益生菌的选择5 小结 1 简介 1 1发展概况1 1 1古老的文明1 1 2年轻的领域1 2几个概念1 2 1益生菌 probiotics 1 2 2益生素 prebiotics 1 2 3合生元 synbiotics 1 1发展概况1 1 1古老的文明 微生物在食品中的应用可以追溯到数千年以前 其中人们最熟悉的应当是酒 酸奶和其他发酵饮料 这是人类文明的一个组成部分 也是益生菌制剂悠久历史的见证 1 1 2年轻的领域益生菌在理论上的概念是在二十世纪初期才提出来的 而将其作为一个专门的科学领域进行研究开发 则是二十世纪80年代以来的事情 1 梅契尼科夫的理论2 酸奶风靡欧亚3 肠道菌群的秘密 1 2几个概念1 2 1益生菌 probiotics Havenaar 1992年 益生菌是单个或多种微生物的活菌培养物 当用于动物或人时 可通过促进天然微生物菌群的特性而对宿主产生有益的影响 EC 1999 用做食品成分 有益健康的活的微生物 1 2 2益生素 prebiotics 益生素是一类宿主不能消化的食物成分 能选择性地促进肠道某种或某些有益微生物生长 从而产生有益的影响 目前最常用的是功能性低聚糖 如大豆低聚糖 Soybeanoligosaccharide 低聚果糖 Fructooligosaccharide 乳酮糖 Lactulose 异麦芽低聚糖 Isomaltooligosaccharide 等 1 2 3合生元 synbiotics 是将益生素与益生菌结合使用 共同产生效应 维持和增加有益菌群的数量 目前国内外已有产品 2 肠道菌群和营养代谢 2 1结肠中碳水化合物的代谢2 2蛋白质酶解和氨基酸发酵2 3脂类代谢2 4短链脂肪酸2 5结肠中毒性物质的去除 2 1结肠中碳水化合物的代谢 2 1 1内源性碳水化合物的代谢2 1 2外源性碳水化合物的代谢 2 1 1内源性碳水化合物的代谢主要包括粘蛋白 mucin 和其他糖蛋白 1 粘蛋白的代谢粘蛋白为杯状细胞 gobletcell 所分泌 犹如消化道黏膜表面的保护屏障 对维持结肠的健康有着非常重要的作用 粘蛋白的降解可能是多种微生物持续协同作用的结果 这些细菌的纯培养物只能在有限的程度内降解粘蛋白 2 其他糖蛋白的代谢类似粘蛋白寡糖的其他糖类 包括细菌细胞壁的一些物质 肠上皮细胞的鞘糖脂类 glycosphingolipids 2 1 2外源性碳水化合物的代谢2 1 2 1非淀粉多糖 nonstarchpolysaccharides NSP 2 1 2 2抗性淀粉 resistantstarch 2 1 2 3低分子量碳水化合物2 1 2 4有双歧因子作用的碳水化合物 2 1 2 1非淀粉多糖 nonstarchpolysaccharides NSP NSP一般指进入结肠可被发酵的纤维素 NSP包括植物细胞壁的主要组分 纤维素 半纤维素 木聚糖 果胶等 植物和种子多糖 菊糖 葡聚糖等 结肠内有多种细菌参与NSP的降解 主要是拟杆菌属 尤其是脆弱拟杆菌类群 Bacteroidesfragilis 以及双歧杆菌 瘤胃球菌和真杆菌 2 1 2 2抗性淀粉 resistantstarch 有些淀粉可以抵抗小肠胰淀粉酶的消化而进入结肠 这些抗消化的淀粉称之为抗性淀粉 抗性淀粉能被肠道微生物发酵 因而对菌群的组成和代谢活性影响较大 动物实验证明 抗性淀粉可提高肠道细菌酶的活性 降低氨的浓度 增加乳杆菌和双歧杆菌的数量 10 100倍 在生理 治疗方面具有意义 2 1 2 3低分子量碳水化合物食品摄入后 部分小分子量碳水化合物受到其他高分子物质的保护 或者快速通过肠道而免于消化 其中有一些重要的双糖 如蔗糖 乳糖等 约有4 以上的蔗糖通过这种方式进入后肠 除上述糖类 还有一些不能在小肠水解的低分子量碳水化合物 主要是天然的寡聚糖 如水苏糖 棉子糖等 还有乳酮糖 帕拉金糖 木糖醇 乳糖醇等 2 1 2 4有双歧因子作用的碳水化合物人体不能吸收但可被肠道细菌发酵的碳水化合物摄入后 能刺激肠道内双歧杆菌和乳杆菌的生长 这些促进体内有益菌生长的物质 一般称作双歧因子 bifidusfactor 如低聚果糖 菊糖 棉子糖等 大多不能被机体或某些有害细菌利用 而只能被乳杆菌和双歧杆菌利用 从而促进这些微生物的生长 2 2蛋白质酶解和氨基酸发酵 膳食及内源性蛋白和肽 1 经宿主消化道和细菌的蛋白酶和肽酶水解生成氨基酸 2 氨基酸经细菌代谢 生成三类产物 H2 CO2 CH4 H2S及硫醇由呼吸和胃肠气中排出 氨 酚 吲哚 胺从尿中排出 有机酸供给宿主生物合成和产能反应 2 3脂类代谢 2 3 1胆汁酸和胆红素代谢2 3 2胆固醇代谢 2 3 1胆汁酸和胆红素代谢1 胆汁酸代谢 是体内胆固醇的主要代谢产物 胆酸和鹅脱氧胆酸是胆汁酸中最重要的两种成分 微生物在胆汁酸的降解中起了重要的作用 只有在微生物酶的作用下 结合型胆汁酸才能分解 因此无菌动物体内只有结合型胆汁酸 2 胆红素代谢 肠道微生物起了重要的作用 胆红素代谢过程中 每一步都涉及到特异性的酶和特异功能的蛋白质 如 葡萄糖醛酸酶 只有少量由机体本身产生 绝大多数是由肠道微生物产生 它可使结合胆红素脱去葡糖醛酸 这是胆红素代谢的重要环节 大量使用抗生素后 粪便中粪胆素原含量明显降低 这可能是抑制肠道细菌而引起的 2 3 2胆固醇的代谢胆固醇可在体内合成 也可从动物性食物中获得 食物中的胆固醇多以游离形式存在 吸收后80 90 的游离胆固醇与脂肪酸结合为胆固醇脂 进入体循环 未被吸收的食物胆固醇在肠道被细菌还原为粪固醇排出体外 转化胆固醇的微生物是一类严格厌氧 革兰氏阳性 无芽孢球杆菌 对无菌动物而言 没有肠道微生物降解胆固醇的途径 因而同样饲喂条件下 无菌动物血清中胆固醇含量要比常规鼠高许多 给动物口服产粪固醇真杆菌会产生明显的低胆固醇血症状 食物种类可能对肠道菌产生粪固醇有一定影响 2 4短链脂肪酸 2 4 1概述短链脂肪酸 shortchainfattyacids SCFA 也常称作挥发性脂肪酸 主要包括乙酸 丙酸 异丁酸 丁酸 异戊酸 戊酸 异己酸和己酸 其中乙酸 丙酸和丁酸含量最高 是肠道中主要的SCFA SCFA主要来自大肠内蛋白质和碳水化合物的代谢 是肠道细菌发酵的主要产物 人结肠中主要的SCFA 2 4 2SCFA的功能可调节肠道菌群 维持体液和电解质的平衡 给宿主提供能量 给肠道上皮细胞提供营养等 尤其丁酸 对结肠上皮细胞有很大的意义 其功能有 能量来源 细胞膜脂类合成的基质 促进消化道细胞生长 诱导细胞分化 影响基因表达 与细胞骨架构建改变有关 增加组蛋白乙酰化 诱导细胞编程死亡等 5 结肠中毒性物质的去除 5 1肠道菌对甲基汞的作用甲基汞是一种高毒性物质 可引起中毒 如20世纪60年代日本发生的水俣病 甲基汞能迅速地被肠道完全吸收 粪便是最主要的排出途径 大部分排出的汞 50 90 是以盐的形式存在 因而甲基汞的脱甲基作用可能是体内有机汞排出的关键 无菌动物 或肠道菌群受到抗生素抑制的动物 汞的排出明显减少 体内汞的积累明显增加 常规小鼠体内汞消除的半衰期为10天 而抗生素处理的小鼠增加到100天 这说明肠道菌群在汞的代谢和解毒中具有相当重要的作用 5 2其他研究发现肠道细菌可以结合在某些致癌物质上 这种结合导致这些突变剂的活性降低 因为当致癌物质和肠道细菌结合后 减少了结肠黏膜的吸收和结肠黏膜的损伤 表现出抗致癌剂的作用 这也可以认为是结肠细菌的非特异性保护作用 3 益生菌的功能 3 1对病原菌的排除拮抗作用 3 2免疫促进和免疫调节 3 3抗肿瘤 抗突变活性 3 4防治胃肠道疾病 婴幼儿腹泻 乳糖不耐受症 旅游者腹泻 肠易激综合征 便秘 腹泻等 3 5降低血脂 降低血压 降低胆固醇 3 6其他 阴道炎 牙齿病变 肝病等 3 1对病原菌的排除拮抗作用 作用机制 产生活性物质 如有机酸 细菌素 H2O2 酶等 竞争吸附位点 竞争营养物质 3 2免疫促进和免疫调节 作用机制刺激巨噬细胞 调控细胞因子基因表达 诱导产生细胞因子 促进非特异性免疫 与黏膜免疫相关 3 3抗肿瘤 抗突变活性 作用机制具有抗肿瘤活性的细菌类生物调节剂 通过改善菌群及其代谢 减少致癌物质的产生 增强细胞免疫活性 增加NO IL 6 IL 1的量和活性 产生抗突变物质 菌体结合有毒物质 3 4防治胃肠道疾病 作用机制调整恢复菌群 竞争营养及黏附受体 抑制病原菌的定植 产生抗体 抗毒素 细菌素等活性物质 抑制腐败菌病原菌的生长 免疫激活 3 5降低血压 降低胆固醇 作用机制改善菌群平衡 产生短链脂肪酸 菌细胞生长时可摄入结合胆固醇 一些乳酸菌可产生降解胆固醇的酶 可产生糖肽物质 3 6其他 作用机制产生抑菌物质 如H2O2 细菌素等 产生有机酸 如乳酸 乙酸等 及其他生理活性物质 降低肠源性内毒素和血氨 提高细胞免疫水平 排斥病原菌定植 4 1适用性4 2可行性4 3竞争性4 4功能性 4 益生菌的选择 4 1适用性 准确的分类位置 最好是应用对象的正常细菌 如人来源的细菌用于人 对每一种使用的细菌 都要有独立的分析资料 无毒 不致病 达到GRAS要求 4 2可行性 易于大量生产保存 适应制备过程中复苏 培养 浓缩 冷冻 干燥 分装等工艺要求 活菌数量高 存活能力强 最好在106 108 培养物特性在制备 储存 运输时保持稳定 发酵或添加后可赋予产品良好的感官品质 至少不产生不需要的品质 遗传性状稳定经得起检验 4 3竞争性 抗胃酸 抗胆汁 进入体内能在目标位点存活繁殖 并有代谢活性 能与正常菌群 包括相同的或相近的种 竞争 具有抵抗原来菌群所产生的酸 细菌素以及其他抗微生物物质的能力 良好的吸附和定植能力 4 4功能性 能发挥一种或多种可在临床证实的有益健康的作用 对致病或有害微生物具有拮抗作用 产生抗微生物的物质 细菌素 过氧化氢 有机酸或其它抑菌性物质 免疫刺激和调节作用 抗突变 抗肿瘤作用 产生生物活性物质 酶 多糖 多肽等 5 小结 5 1正常菌群对人类健康具有重要意义 5 2菌群与体内营养物质的代谢紧密相关 5 3肠道菌群是益生菌的重要来源 5 4益生菌的有益功能是通过促进天然菌群的作用来实现的 5 5益生素是一类促进有益菌生长的物质 正常存在于食物中 6 1追踪技术 trackingmethods 6 2鉴定技术 identificationmethods 6 3原位技术 insitumethods 六 用于益生菌和肠道菌的分子生物学技术 6 1 1菌落核酸探针杂交 ColonyHybridizationwithNucleicAcidProbes 6 1 2脉冲场凝胶电泳 PulseFieldGelElectrophoresis 6 1 3核酸分型 Ribotyping 6 1 4多重PCR MultiplePCR 6 1 5限制片长多态性 RestrictionFragmentLengthPolymorphism RFLP 6 1 6任意引物PCR ArbitraryPrimedPCR AP PCR 6 1 7三联任意引物PCR TripletAP PCR 6 1追踪技术 6 1 1菌落核酸探针杂交一些细菌种或属的特异性探针已经得到 对于检测粪便或肠内容物样品中的微生物类型非常有用 尽管菌株特异性的探针很难构建 但随着基因组序列的完成 将会促进这些探针的设计 探针的选择主要考虑其对特定微生物属 种或菌株的特异性 基本原理 探针特异性是本法的关键 用鸟枪法或直接法制备探针 依据rRNA区域产生的短寡核苷酸片段 20bs 是制备属或种特异探针最常用的方法 可利用rRNA序列数据库及计算机模型检测探针的特异性 用酶法 荧光或放射性技术标记探针 从菌落提取核酸 利用探针检测 6 1 2脉冲场凝胶电泳 PFGE 用于细菌指纹技术 将分离物的基因组消化为几个 5 50 大分子片段 高分子量DNA分子处在两个相互垂直的 交替变换的电场中 使分子量大小不等的DNA片段分开 对特定的微生物有高度的鉴别作用 6 1 3核酸分型大多数细菌基因组一般含有多个 8个以上 拷贝的rRNA 因此可以利用RFLP技术 分析特定的含有rRNA基因的基因组的限制性片段 通过限制片长多态性的特点 来对其进行区分鉴定 基本方法 足够的培养物 提取总DNA 利用限制性内切酶将DNA酶切为不同大小的片段 琼脂糖凝胶电泳分离 用16S 23S 或5SrRNA探针杂交 探针检测 6 1 4多重PCR多重PCR 使用多个引物 以保证同时扩增大量的目标DNA片段 扩增越多 可靠性越高 需要设计合适的反应条件 6 1 516SrRNA基因的RFLP以基因中通用保守片段为引物 快速扩增16SrRNA的技术 扩增子用适当的限制性内切酶酶切 然后进行琼脂糖电泳分离 以形成有鉴别特征的多态性 由于基因的保守特性 该技术的辩别能力较低 6 1 6任意引物PCRAP PCR用单个随意选择