IPTG诱导蛋白表达全面介绍.doc

IPTG全面介绍：优点使用配制特点摘要 :异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。IPTG 常用于需要诱导 -半乳糖苷酶活性的克隆实验。它常与 X-Gal 或 Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导 lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。IPTG 与 lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止 -半乳糖苷酶编码基因 lacZ 的抑制。中文名：异丙基-D-硫代半乳糖苷( IPTG)英文名称：Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside用途：异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。IPTG 常用于需要诱导 -半乳糖苷酶活性的克隆实验。它常与 X-Gal 或 Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导 lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。IPTG 与 lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止 -半乳糖苷酶编码基因 lacZ 的抑制。使用方法：首先把IPTG配制成23.83 mg/ml(100 mM)的水溶液，并进行过滤除菌后保存。然后在100 ml的琼脂培养基中，加入100 l的上述溶液、200 l的X-Gal(20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100 l的Amp(100 mg/ml)，制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。当dna片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体)，然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的IPTG、XGal、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。配制方法：在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22m滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20。优点：1.能诱导酶的合成，但又不被分解的分子，称为安慰诱导物。由于乳糖虽可诱导酶的合成，但又随之分解，产生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物来进行各种实验。2.IPTG不被菌体代谢，为乳糖类似物，一旦进入细胞就会产生持续长久的诱导效果，所以IPTG的诱导效率高，往往只需要很少量(1mmol/L)即可达到理想诱导效果。由于IPTG不被代谢，在胞内专一诱导外源蛋白的表达。不受细胞代谢的影响，诱导效果持续稳定。乳糖有双效作用，既能做为诱导剂异乳糖的前体物质，又可以做碳源，在诱导过程中，很不稳定，IPTG因其优异的稳定性决定了它适合做实验研究用。3.IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被抄送。4.半乳糖苷键中用硫代替了氧，失去了水解活性，但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物与酶位点的亲和力相同，IPTG虽不为半乳糖苷酶所识别，但它是lac基因簇十分有效的诱导物。注意事项：培养噬菌体时，Top agar中的添加量为：25 l/3 ml(24 mg/ml)。含有IPTG 的培养基4避光保存，须在12 周内使用。保存：2-8C冷藏保存，配制好后保存于-20C，室温可放置一个月。远离热源及氧化剂。IPTG诱导蛋白表达的原理.材料.实验方法摘要 :E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动子序列P及一个调节基因I.I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态.在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点.由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动子序列P及一个调节基因I.I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态.在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点.由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达 .在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态.此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动.当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导.在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身.乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖.后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录.异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用.材料：1、诱导表达材料：( 1 ) LB (LuriaBertani)培养基：酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g琼脂(Agar) 1-2%蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中,0 . 22 m 滤膜过滤除菌,分装成1 mL /份,-20 保存.( 3 ) l凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS (电泳级)0.1 % 溴酚蓝10 % 甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料：1 )酶溶法(1)裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI(2)50 mmol / L 苯甲基磺酰氟(PMSF ).(3)10 mg / mL 溶菌酶.(4)脱氧胆酸.(5)1 mg / mL DNase I.2 )超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液.( 2 ) 2SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 % 溴酚蓝20 % 甘油实验方案：1、外源基因的诱导表达：(1)用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因.( 2 )按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌.( 3 )筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱,DNA 序列测定,确定无误后进行下一步.( 4 )如果表达载体的原核启动子为PL 启动子,则在30 -32 培养数小时,使培养液的OD600达0.4-0.6 ,迅速使温度升至42 继续培养3 -5h ;如果表达载体的原核启动子为tac 等,则37 培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L.继续培养3 -5h .( 5 )取上述培养液1 mL , 1000g 离心,1 min ,沉淀,加100 L 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS -PAGE 检测.2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化：细菌的裂解常用方法有： 高温珠磨法; 高压匀浆; 超声破碎法; 酶溶法; 化学渗透等.前三种方法属机械破碎法,并且方法 、 已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛.下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤.酶溶法.常用的溶解酶有溶菌酶;-1,3 -葡聚糖酶;-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等.溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著.主要步骤为：4 ,5000rpm 离心,15 min ,收集诱导表达的细菌培养液(100 mL ).弃上清,约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液,悬浮沉淀.试验进行到了IPTG诱导表达后跑SDS-PAGE胶的环节， 首先，我获得了我的目的基因，与pET28a连接后，成功构建载体。我进行了菌液PCR验证，质粒PCR验证，质粒双酶切验证，之后是送去测序。所有的结果足够表明我已经构建载体成功了。之后就是转化BL21表达菌株中。转到BL21表达菌株时间大概是15年1月份左右，直到过年后回来开始摇菌，诱导，跑胶，问题就是这时候出现的。以下是我做试验的整个流程，望大神给些建议。1、诱导与提取目的蛋白 菌种活化。重组载体pET-28a-SAMDC和空质粒pET-28a的单菌落，分别接种于25mL LB液体培养基（KanR）的试管中，37，180r/min，过夜振荡培养。 菌种扩培。取活化好的菌种按1%的量接种于100mL的LB液体培养基（KanR），摇匀，37，200r/min，振荡培养3h。 融合蛋白的诱导表达。向菌液中分别加入终浓度的IPTG（0.1、0.5、1.0 mmol/L）作诱导剂，37，180r/min，振荡培养4h（3、4、5、6h）。 目的蛋白的提取。A. 经诱导后取1mL菌液，4 12000g，10min收集菌体;吸出菌液，用0.5mL预冷的50mmol/LTris-Cl（pH7.4）漩涡振荡使沉淀的菌体复悬，4 12000g，离心10min；再次吸出上清液，小心地吸净管壁上的液滴，尽可能地使沉淀不带有残留的液体；加入100uL ddH2O，漩涡振荡使沉淀复悬，一旦菌体分散开来立即加入等体积的1%SDS磷酸缓冲液，继续振荡20s；超声波处理。超声处理为7min，超3s，停10s，功率为75w。超声波处理后，样品4 12000g，10min，将上清移至另一管中，沉淀用少量1%SDS溶解，分别加入等体积的2SDS凝胶上样缓冲液；快速离心，将菌悬液收集在离心管底部，沸水浴中放置5min；分别取15uL样品进行SDS-PAGE电泳检测。图片即为SDS胶跑完后的状态。我的蛋白预测应该是在40kDa左右，可是在40kDa左右处根本没有我的目的蛋白。反而在30kDa处出现奇怪的条带.做了几次都是这样的状态。同实验室的也有人在做这一步，她的蛋白预测大小为38kDa，但是跑出来的胶跟我的一模一样。还有一个同学她是前两次做成功了可以明显看到目的蛋白表达，在60kDa左右，但是从大概4月份开始条带就没有了，我们一直找不到原因，难道这个也是可以传染的？去问实验室的小老师，老师