骨髓间充质干细胞向神经细胞、成骨细胞诱导分化的研究.pdf

苏州大学 硕士学位论文 骨髓间充质干细胞向神经细胞 成骨细胞诱导分化的研究 姓名 段祥 申请学位级别 硕士 专业 生物化学与分子生物学 指导教师 张焕相 20070501 骨髓间充质干细胞向神经细胞 成骨细胞诱导分化的研究骨髓间充质干细胞向神经细胞 成骨细胞诱导分化的研究 作者 段祥 学位授予单位 苏州大学 相似文献 10条 相似文献 10条 1 期刊论文 王志顺 王江泳 王保芝 王琳 刘长安 王丽 刘贵生 Wang Zhi shun Wang Jiang yong Wang Bao zhi Wang Lin Liu Chang an Wang Li Liu Gui sheng 骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的超微结构改变 中国组 织工程研究与临床康复2009 13 1 背景 目前尚缺乏骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞超微结构特点的观察 目的 采用全骨髓培养 贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞 诱 导其向成骨细胞方向分化 利用光镜和电镜观察诱导和未诱导分化细胞的细微和超微结构特点 设计 时间及地点 观察实验 于2007 03 2008 04在河北医 科大学人体解剖教研室和白求恩国际和平医院骨科完成 材料 成年新西兰大白兔由自求恩国际和平医院实验动物中心提供 Hitachi S 3500N型扫描电镜 和Hitachi 7500型透射电镜 方法 从新西兰大白兔骼后上嵴处抽取骨髓 经原代及传代培养后 取部分第3代细胞加入诱导剂 诱导剂为10 mmol L 甘油 磷酸钠 10 8 mmol L地塞米松 50 mg L维生素C 培养2周后 诱导和未加诱导的骨髓间充质干细胞进行碱性磷酸酶 骨形态发生蛋白和钙化结节检测 主要 观察指标 光镜观察骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞的一般形态学特征 电镜观察骨髓间充质干细胞和成骨细胞的超微结构特点 结果 培养的 第3代骨髓间充质干细胞 其碱性磷酸酶染色呈强阳性反应 钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测 均呈现阴性结果 经向成骨细胞诱导分化后 其碱性磷酸酶染色 钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测 均呈现阳性反应 光镜和扫描电镜观察显示 骨髓间充质干细胞大部分呈长梭形 少量呈星形 经向成骨细胞诱导分化后 细胞体积增大 更加饱满 似鱼群样排列 透射电镜观察显示 骨髓间充质干细胞的细胞器较丰富 向成骨细胞诱导 分化后 其线粒体明显增多 出现较多的基质小泡 髓样体和空泡状结构 结论 骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后细胞的超微结构表现为胞浆中出现增多 的基质小泡 髓样体和空泡状结构 2 学位论文 梁文杰 猪骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后免疫原性的实验研究 2007 研究背景及意义 严重创伤 感染 肿瘤等原因所致的骨缺损在临床治疗中非常常见 目前常用的治疗方法是植骨术 而严重的骨缺损用现有的方 法难以获得满意的疗效 骨组织工程的兴起为解决大段骨缺损的难题提供了新的途径 骨髓间充质干细胞 mesenchymal stem cell MSCs 被认为是骨组 织工程最佳的种子细胞 因为这种细胞取材方便 可通过穿刺获得 创伤小 取材后并发症少 细胞培养增殖快 在体内外成骨诱导环境下可分化为骨 组织 而且具有多向分化潜能 此外 MSCs也容易分离和培养 尽管自体MSCs或成骨细胞用于动物及临床个体化治疗已经取得了良好的结果 但MSCs在 骨髓中含量很少 并随着年龄的增长减少 现有方法体外迅速扩增困难 而且一些自身免疫性疾病患者 其MSCs增殖能力明显减弱 随着培养代数增加 可能出现 反分化 现象和致瘤性 从而失去了细胞应有的功能和安全性 因此 自体骨髓间充质干细胞的应用会受来源和数量限制 难以满足临床 随取随用 的要求 建立同种异体MSCs种子细胞库是解决这些问题的捷径 也是组织工程从实验室走向产业化的重要前提 近年来 国内外研究发现 MSCs具有免疫调节作用 已往低等级动物模型也证明同种异体种子细胞及其构建的组织工程肌腱 软骨 骨组织植入体内免疫反应轻微 不足以影响工 程化组织植入体内后的修复功能 因此 同种异体骨组织工程研究前景充满潜力和希望 目的 1 猪骨髓分离培养MSCs并在体外诱导成骨细胞 并对其细胞生物学特性进行观察 探讨MSCs最佳的培养方法和条件 2 研究MSCs成骨诱导 分化后在不同条件下对外周血单个核细胞增殖的影响及细胞因子分泌情况 研究MSCs免疫原性及 IFN 对其免疫原性的影响 探讨MSCs免疫调节机制 为体内实验提供依据 3 成骨诱导分化后MSCs与脱钙骨基质材料复合构建组织工程骨 植入猪皮下并和单纯脱钙骨基质材料植入进行比较 以了解同 种异体组织工程骨在体内的免疫排斥反应程度及异位成骨能力 从而了解以MSCs为种子细胞的同种异体组织工程骨移植的可行性 方法 1 猪骨髓间充质干细胞生物学特性 1 无菌条件下在小香猪髂嵴处穿刺抽取2 5 ml骨髓 经密度梯度离心分离提纯M S C s 分别培养在含 5 胎牛血清的 A DMEM培养液和10 胎牛血清F12 DMEM培养液里 观察第3d 第5 d的CFU F数量 最大传代次数 细胞长满时间 FACS检测第3代细胞 的CD14 CD29 CD44 CD45 SLA SLA 表达 2 比较MSCs及DOC细胞贴壁率 生长曲线 生长周期 3 用碱性磷酸酶染色 Von Kossa染色 茜 素红法 骨钙素免疫组化染色鉴定成骨诱导分化后的MSCs 2 猪骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后免疫原性实验研究 1 以未分化的骨髓闾充质干细 胞为对照 采用流式细胞技术分别检测未诱导 成骨诱导的MSCs MSCs IFN DOC IFN SLA分子的表达 2 采用RT PCR技术分别检测DOC 未分化 的MSCs MSCs IFN 组 DOC IFN 的SLA基因表达情况 3 采用混合淋巴反应观察 不同数量级的DOC对PBMC增殖的影响 DOC对经丝分裂原刺激的 PBMC增殖的影响 DOC经IFN 预处理后体外对单向混合淋巴反应体系影响 DOC经IFN 预处理后体外对双向混合淋巴反应体系的影响 4 检测 MSCs和DOC未经过和经过IFN 处理后其培养上清TGF 1和IL 10的分泌情况3 同种异体组织工程骨猪皮下植入免疫排斥及异位成骨实验研究 1 对新鲜 猪胫骨采用脱脂 脱钙 脱蛋白方法制备猪DB M材料并在光镜下和电镜下观察形态学和组织学结构 2 体外组织工程骨构建并在光镜下和电镜下细胞附 着 生长 基质分泌情况 3 以DBM材料为对照 将同种异体组织工程骨植入15头免疫功能健全的异体小香猪背侧脊柱旁左侧皮下作为实验组 对侧植 入单纯的脱钙骨基质猪皮下 采用HE和Masson 染色观测1w 2w 4w 8w 12w异位成骨情况 并用ELISA法检测术后局部组织和外周血1w 2w 4w 8w 12w的IL 2及其TNF 表达水平 结果 1 猪骨髓间充质干细胞及成骨诱导分化后生物学特性 1 在A DMEM与F12 DMEM培养液培养的MSCs具有相同特征 细胞呈纺锤形或三角形 类 似纤维细胞 旋涡样排列 第3代细胞FAC S检测结果显示 分离培养的细胞CD29 CD44 SLA 表达强阳性 而CD14 CD34 SLA 阴性 与F12 DMEM培养液培养的MSCs相比 A DMEM培养的MSCs 原代培养3d 5d贴壁生长的细胞克隆数较多 原代细胞生长至80 100 所需时间较短 最大传代次数 多 2 MSCs及DOC细胞贴壁率无明显差别 生长曲线MSCs倍增时间为36 8h DOC为38 9h MSCs和DOC细胞周期比较 MSCs细胞周期中S G比例较多 G比例较少 表明 MSCs生长增殖速度较DOC快 3 成骨诱导14d Von Kossa 染色见细胞间质有大量的钙盐沉积 ALP染色显示细胞呈85 阳性 茜素红法见到团块状细胞中有钙盐沉积 免疫细胞化学检测见到骨钙素阳性表达细胞 2 猪骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后免疫原性实验研究 1 FACS检测结果显示 MSCs IFN 组 DOC IFN 组sLA 表达上调 P 0 05 SLA 表达明显上调 P 0 01 2 RT PCR结果显示 DOC组 MSCs IFN 组 DOC 1FN 组SLA P1 P14 表达上调 P 0 05 SLA DRA DRB DQA DQB 表达明显上调 P 0 01 3 大于1 10数量 级以上DOC不能刺激PBMC增殖 低于1 10数量级对PBMC有增殖作用 抑制作用与细胞数量成正相关 DOC能抑制经PHA刺激的PBMC增殖 DOC经 IFN 预处理后仍然能抑制PHA和Con A刺激的PBMC增殖 DOC经IFN 预处理后体外对双向混合淋巴反应体系 hPBMC pPBMC PBMC增殖有抑制作用 4 MSCs和DOC均能分泌TGF 1和IL 10 DOC分泌的IL 10水平高于MSCs P 0 01 但经IFN 刺激后 MSCs分泌的TGF 1水平明显高于未经IFN 刺激 的MSCs 而经IFN 刺激后DOC分泌的TGF 1明显低于未经IFN 刺激的DOC 3 同种异体组织工程骨猪皮下植入免疫排斥及异位成骨实验研究 1 制备 猪DBM材料保持天然的网状结构 2 成骨诱导分化后MSCs与脱钙骨基质材料复合7天显示细胞附着于材料表面和孔隙内壁 并分裂增殖数目倍增 SEM观 察 细胞排列规则 周围有细胞外基质分泌 3 所有小香猪术后无发热 畏寒等全身反应 取材所见术后1 2 4周双侧植入物周围均见轻微组织反应 但于8 12周逐渐消失 组织学观察 异位成骨以软骨内化骨为主 结论 1 猪MSCs成骨能力强 在成骨诱导条件下可向成骨细胞分化 表达碱性磷酸酶和骨钙素 具有作为种子细胞的潜力 2 体外实验表明猪 MSCs的诱导成骨后仍保持低免疫原性 在炎前细胞因子刺激下其免疫原性可能增强 但其可能通过分泌一些具有免疫调节作用的细胞因子来调控免疫反 应 3 体内实验表明同种异体组织工程骨植入具有较好的异位成骨效果 但早期可引发宿主轻微的免疫反应 但随时间延长 免疫反应逐渐消失 总之 同种异体MSCs作为种子细胞与DBM材料复合培养可能是体外组织工程骨构建的一种较好选择 3 期刊论文 龚宜超 董雅娟 柏学进 封纪武 岳福杰 张廷龙 沈召莲 Gong Yi chao Dong Ya juan Bai Xue jin Feng Ji wu Yue Fu jie Zhang Ting long Shon Zhao lian 骨髓间充质干细胞体外诱导分化及在细胞工程和基因 工程中的应用 中国组织工程研究与临床康复2008 12 25 学术背景 骨髓间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的成体干细胞 其体外诱导分化的不同组织对于骨及软骨组织工程 心血管疾病 神经系统疾 病 免疫系统疾病等的治疗具有广阔的应用前景 目的 总结骨髓间充质干细胞体外诱导分化的研究进展 检索策略 由该论文的研究人员应用计算机检索 Pubmed数据库1998 01 2008 01期间的相关文献 检索词为 Mesenchyrmal stem cell differtation neuron osteoblast Chondrocyte adipocyte sarcoblast endotheliocyte Tissue repair gene therapy 并限定文章语言种类为 English 同时检索万方数据库2002 01 2008 01期间的相关文献 检索词为 骨髓间充质干细胞 诱导分化 神经细胞 基因治疗 共检索到52篇文献 对资料 进行初审 纳入标准 与骨髓间充质干细胞体外诱导分化密切相关 同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章 排除标准 重复性研究 27篇文 献符合纳入标准 排除的25篇为内容陈旧或重复文献 文献评价 文献的来源主要是骨髓间充质干细胞体外诱导分化方面的随机对照实验 5篇涉及体外诱导 分化为神经细胞的研究 4篇涉及体外诱导分化为成骨组织的研究 1篇涉及体外诱导分化为软骨组织的研究 2篇涉及体外诱导分化为脂肪细胞的研究 2篇 涉及体外诱导分化为成肌细胞研究 3篇涉及体外诱导分化为内皮细胞的研究 3篇涉及体外诱导分化为肝细胞的研究 7篇涉及其在医学上的应用 资料综合 骨髓间充质干细胞具有自我更新 增殖和多向分化潜能 在不同生物环境和细胞因子的作用下可分化为不同类型的细胞 研究表明 骨髓间充质干细胞在 体外适宜的诱导条件下可以分化为神经 成骨 软骨 脂肪 心肌 肝脏等多种细胞 而且骨髓间充质干细胞在组织修复和基因治疗方面的应用已取得较 大进展 在人类医学上具有广阔的应用前景 结论 骨髓间充质干细胞被认为是细胞工程和基因工程理想的种子细胞 并开启了临床应用干细胞治疗的时代 4 学位论文 马俊伟 骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的实验研究 2009 血管化和骨再生是骨愈合过程中两个最基本环节 骨组织工程学的迅速发展 为骨再生和脊柱融合提供了合乎生物学原则的思路 当前该领域的研 究主要集中于种子细胞的获取和诱导条件的探索 骨髓间充质干细胞 marrow mesenchymal stem cells MSCs 因其具有低免疫原性 多向分化及高增殖 潜能而倍受关注 我们实验将探讨用血管内皮细胞生长因子 VEGF165 诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞 为组织工程提供新的种子细胞 并探 讨试验条件 目的 研究骨髓间充质干细胞 MSCs 向血管内皮细胞的诱导分化 为复杂器官组织工程血管化及细胞移植修复损伤组织提供理想的细胞来源 探讨 不同浓度的血管内皮细胞生长因子 VEGF165 对骨髓间充质干细胞增殖及向血管内皮细胞分化的影响 方法 1 骨髓间充质干细胞取自Wistar大鼠 体重100g左右 三周龄 雌雄不限 中国医科大学实验动物中心提供 试剂为血管内皮生长因子 VEGF165 兔抗鼠VEGFR1 Flt1抗体 浓缩型免疫组化试剂盒 2采用密度梯度离心法与贴壁分离法相结合分离 纯化大鼠BMSCs 用含10 胎牛血清的 L DMEM培养至第三代作为种子细胞 对照组A组不加生长因子 实验组B C D E组分别加入5ng ml 10ng ml 50ng ml 100ng ml VEGF165 培养 24小时后各组间行细胞增殖比较 14天后终止培养 观察各组细胞形态学改变 并对各组行血管内皮细胞生长因子受体1 VEGFR1 Flt1 免疫细胞化学染 色 结果 对于体外培养的骨髓间充质干细胞 含不同浓度VEGF165的各组培养液对骨髓间充质干细胞增殖作用大小不同 差异有统计学意义 并且含 VEGF165的各组培养液与对照组比较 其能够诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化 其诱导后的阳性细胞比例分别为2 1598 0 2555 30 3591 5 1687 44 7643 2 1011 56 0111 2 9603 86 2438 0 9663 差异有统计学意义 且实验组各组之间诱导效果不同 结论 骨髓间充质干细胞具有向血管内皮细胞诱导分化的能力 可以作为组织工程的种子细胞 VEGF165可以促进骨髓间充值干细胞增殖和向血管内 皮细胞诱导分化 并且其促增殖作用和诱导分化作用存在着剂量依赖关系 5 期刊论文 张建富 孟庆海 金澎 刘广义 Zhang Jian fu Meng Qing hai Jin Peng Liu Guang yi 全骨髓贴壁法 获纯化骨髓间充质干细胞向神经干细胞的诱导分化 中国组织工程研究与临床康复2008 12 12 目的 来源于骨髓间充质干细胞的神经干细胞是最近研究的一个热点 实验拟进一步验证通过全骨髓贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞并诱导分化为 神经干细胞的效率 并对其的体内外标记进行了观察 方法 实验于2006 11 2007 05在青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所完成 实验材料 选取出 生4周左右Wistar大鼠 雌雄不拘 SPF级 体质量200 g左右 由青岛市实验动物和动物实验中心提供 实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准 实验方 法 选用出生4周左右Wistar大鼠 由其股骨和胫骨分离纯化骨髓间充质干细胞 加碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子诱导其分化为神经干细胞 并进 行免疫组织化学鉴定 以5 溴脱氧尿嘧啶核苷 BrdU 标记神经干细胞 在24孔板中进行细胞免疫组织化学和免疫荧光鉴定 将标记的神经干细胞定位注入大 鼠基底节区 1周后取脑作石蜡切片 进行免疫组织化学和免疫荧光染色 结果 获得了较纯化的骨髓间充质干细胞 经诱导72 h后 部分细胞增殖分裂成小圆 形 呈团簇状半悬浮状态 继续培养72 h可见细胞呈现典型神经元样改变 细胞伸出两个或多个突起 胞体呈多角形或不规则形 折光性较强 细胞突起之间 相互连接成网状 可见细胞核及核仁 经诱导后有巢蛋白 神经元特异性烯醇化酶 胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达 采用BrdU掺入DNA合成期的神经干细 胞 1周后体内外标记阳性率 85 结论 采用全骨髓贴擘法可获得较纯化的骨髓间充质干细胞 其在适宜的诱导分化条件下可诱导分化神经干细胞 BrdU可 作为神经干细胞体内示踪的理想标记物 6 学位论文 金晔 肝脏富集转录因子在体外肝细胞分化过程中的作用研究 2008 研究背景和目的 肝脏是体内进行物质代谢的重要器官 其中肝细胞约占肝脏组织的80 肝细胞特异表达一系列编码血浆蛋白 凝血因子和多种肝脏解毒作用及维 持糖类物质 脂肪和胆固醇代谢相关酶的功能基因 肝细胞特异表达基因的功能分析研究发现这些基因的调节区由结合不同家族的肝细胞转录因子的顺 式作用元件组成 不同家族的肝脏富集转录因子形成蛋白复合物协同调控肝细胞特异基因表达的启动和维持 肝细胞核因子4 HNF4 在很多肝细胞功能基因的启动子或增强子上有结合活性 可以直接调控多达40 左右的肝细胞特异基因的表达 此外 HNF4 还可以通过调控多种其它家族肝细胞分化相关转录因子的表达间接调节肝细胞功能 因此 转录因子HNF4 很可能位于肝细胞相关转录因子调 控网络的上游并对于肝细胞功能基因的表达起核心调控作用 目前 对于HNF4 的功能研究集中在胚胎肝脏发育和成熟肝细胞功能维持方面 但是对于 肝细胞分化过程尤其是体外诱导分化过程中HNF4 的表达和尚未见报道 骨髓干细胞 bone marrow stem cells BMSCs 可以分化为肝前体细胞和肝细胞 并具有取材容易 增殖能力强 体外培养 传代及扩增容易的特点 可以作为研究体外诱导分化肝细胞的可靠来源 但是骨髓干细胞诱导向成熟肝细胞分化的具体诱导机制目前尚不清楚 因此 本研究在骨髓间充质干 细胞体外向肝细胞诱导分化过程中的培养细胞进行肝细胞标志基因及转录因子mRNA表达水平检测 在此基础上应用RNA干扰技术抑制转录因子HNF4 的转 录水平 并深入研究大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞体外诱导分化过程中转录因子HNF4 调控的作用机制 深入了解细胞分化机制 并为临床促进肝细 胞分化增殖提供理论基础 实验方法 1 提取大鼠骨髓细胞诱导其向肝细胞分化 通过形态学表现 ALB免疫荧光染色定位 半定量逆转录 聚合酶链反应 RT PCR 方法检测肝细胞特征 性标志ALB AFP的mRNA的表达 生化方法检测白蛋白 尿素和ALT的在细胞培养液中的浓度以及PAS染色方法检测细胞糖原合成能力来验证大鼠骨髓间充 质干细胞经过体外诱导分化培养后是否具有成熟肝细胞的功能 2 应用半定量RT PCR方法比较肝细胞分化过程中肝脏富集转录因子肝细胞核因子4 HNF4 CCAAT增强子结合蛋白 和 C EBP 和C EBP 在 诱导分化组和对照组细胞中的mRNA表达水平和免疫荧光染色方法在荧光显微镜下观察HNF4 细胞中的表达定位 获得骨髓间充质肝细胞向肝细胞体外诱 导分化过程中上述三种转录因子的表达特征 3 分别在大鼠骨髓干细胞的诱导分化过程中的三个时间点应用RNA干扰技术抑制转录因子HNF4 的mRNA表达 应用Realtime RT PCR及HNF4 免疫荧 光染色方法检测HNF4 mRNA和蛋白水平的表达 检验RNA干扰的抑制效果 同时 应用Realtime RT PCR 细胞培养液生化检测 ALB免疫荧光染色和 PAS染色方法检测HNF4 表达抑制对于诱导分化细胞的肝细胞特异基因ALB AFP和HNF1 的mRNA表达水平 白蛋白表达水平和分泌能力 合成尿素和储存 糖原能力的影响 研究结果 1 大鼠骨髓间充质干细胞经诱导分化培养后细胞具有成熟肝细胞的形态 在大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化培养的7天 14天 18天和 21天四个时间点 成熟肝细胞标志ALB和AFP mRNA的表达水平明显高于非诱导培养对照组细胞 p 0 05 应用ALB的特异性抗体进行的免疫荧光染色显示 骨髓间充质干细胞在分化14天后 细胞质中充满了大量点状 或颗粒状的绿色的荧光染色 此外 诱导分化细胞产生白蛋白 尿素和ALT以及合成及储 存糖原的功能要明显强于对照组细胞 2 在骨髓间充质干细胞体外诱导分化培养细胞中 转录因子HNF4 C EBP 和C EBP mRNA均有表达 其中诱导分化组HNF4 和C EBP 在细胞分 化早期 C EBP 在分化晚期表达分别显著高于对照组 p 0 05 在HNF4 mRNA表达水平显著高于对照组的诱导分化14天时间点 免疫荧光染色显示诱 导分化组细胞有HNF4 特异染色定位于分化细胞核内 而对照组细胞中并未观察到细胞核内有特异染色 3 在骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化的7天 14天和21天三个时间点 对诱导分化细胞瞬时转染HNF4 的siRNA后 HNF4 的mRNA表达水平相比于正常诱导分化细胞降低了40 而HNF4 免疫荧光染色显示转染siRNA的细胞 核内HNF4 的特异染色明显减少 说明转染HNF4 siRNA有效抑制了诱导分化细胞中HNF4 mRNA和蛋白水平的表达 在HNF4 表达下调的细胞中 成熟 肝细胞标志AFP和HNF1 的mRNA表达水平 尿素产生及糖原合成储存能力显著低于同时间点正常诱导分化细胞 另一个肝细胞标志ALB mRNA和蛋白水平的 表达则仅在诱导分化早期受HNF4 的调控 而在诱导分化进行至21天时 ALB的mRNA和蛋白水平的表达水平都与HNF4 表达下调无关 研究结论 1 大鼠骨髓间充质肝细胞在生长因子HGF EGF bFGF 地塞米松和胰岛素的诱导培养下可以分化为具有成熟肝细胞功能和形态的肝细胞样细胞 可 以作为体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的可靠模型 2 肝细胞分化过程中转录因子HNF4 C EBP 和C EBP 呈特征性时序表达 表明骨髓间充质干细胞在向肝细胞分化时 肝细胞相关转录因子的表 达与细胞分化的启动和维持密切相关 3 HNF4 对骨髓间充质干细胞来源的肝细胞的特异标志和大部分生理功能有直接和间接的调控作用 是体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成熟肝细 胞分化过程中的关键转录因子 7 期刊论文 张海垠 冯继 周益民 ZHANG Hai yin FENG Ji ZHOU Yi min 骨髓间充质干细胞向神经细胞体外诱导分 化的研究进展 国际生物医学工程杂志2009 32 2 骨髓间充质干细胞 BMSCs 是一种存在于人和动物骨髓等组织中 具备有多向分化潜能的成体干细胞体系 其具有取材简便 易于体外培养扩增 体内 移植免疫排异反应少 可自体移植避免伦理学争议等众多优势 骨髓间充质干细胞在体外一系列不同的实验方案中 被诱导分化为神经细胞 这为神经系统 受损伤后的修复和再生带来了新希望 结合近几年的研究进展 对骨髓间充质干细胞在体外培养条件下向神经细胞诱导分化的各种方案及其可能机制作一 综述 8 期刊论文 吴晓林 李冬民 马德茂 张晓田 黄石 宋天保 WU Xiao Lin LI Dong Min MA De Mao ZHANG Xiao Tian HUANG Shi SONG Tian Bao 骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记 第四军医大学学报2006 27 21 目的 探讨骨髓间充质干细胞 MSCs 在体外的诱导分化及5 溴脱氧尿嘧啶核苷 Brdu 标记MSCs的可行性 方法 利用密度为1 073 kg L的percoll分离 骨髓的单个核细胞 体外培养与扩增MSCs 取生长良好的第3代细胞 用成骨细胞分化培养液培养21 d 型胶原免疫组化染色和碱性磷酸酶 AKP 组化染色 分别以浓度为5 10和15 mol L的Brdu溶液标记MSCs 孵育12 24 48 72和96 h后免疫组化检测Brdu 确定最佳标记量和最佳标记时间 结果 诱导分化第 21日 AKP染色呈强阳色 型胶原免疫染色呈阳性 10 mol L Brdu标记MSCs的效果最好 随着孵育时间的延长 Brdu标记率逐渐增高 标记72 h后标记 率在90 以上 结论 MSCs在体外一定条件下可定向诱导分化为成骨细胞 用Brdu标记MSCs的最佳浓度为10 mol L 最佳时间是72 h 9 学位论文 刘沉涛 骨髓间充质干细胞向神经细胞诱导分化中免疫性发育的实验研究 2007 新生儿缺氧缺血性脑损伤 hypoxic ischemic brain damage HIBD 是由于围产期各种因素导致的胎儿或新生儿缺氧 缺血引起脑组织损伤 尽管当 今围产医学迅速发展 但HIBD仍是引起新生儿死亡 影响新生儿正常发育 导致儿童脑瘫 精神发育迟滞 学习障碍和癫痫等神经系统伤残的主要原因 Spong 2005 目前临床上缺少特异性的有效手段治疗HIBD 韩玉昆 2000 间充质干细胞移植为临床治疗HIBD开辟了一条崭新的途径 但是 由于缺 氧 缺血损伤导致脑组织弥漫性病变 脑内的动态免疫平衡遭到破坏 是否会诱发对植入细胞的免疫排斥反应呢 本试验旨在观察骨髓MSCs向神经细胞 诱导分化中的免疫学特性发育 以及HIBD模型小鼠脑内移植后的免疫反应 为骨髓MSCs移植治疗新生儿缺氧缺血性脑病 hypoxic ischemic encephalopathy HIE 提供技术平台 试验分为以下三个部分 一 骨髓MSCs向神经细胞分化中的免疫原性发育 目的 探讨骨髓MSCs向神经细胞分化后的移植免疫表型及其对同种异体T细胞增殖的作用 方法 体外分离和培养人骨髓MSCs 用加入碱性成纤维生长因子 basic fibroblast growth factor bFGF 和表皮生长因子 epidermalgrowth factor EGF 的无血清培养基将MSCs诱导分化1周 2周 免疫荧光法和免疫印迹法进行细胞性质鉴定 将细胞分为未分化的MSCs组 MSCs组 MSCs向神 经诱导分化1周的细胞组 Neu1组 和MSCs向神经诱导分化2周的细胞组 Neu2组 流式细胞技术和免疫印迹法检测各组细胞免疫表型 各组细胞分别与同 种异体的T细胞共培养 液闪仪检测T细胞增殖 比较 IFN100U ml预处理48小时前后各组细胞的免疫表型和对T细胞的增殖作用 用spss11 0软件包 及Exce17 0分析统计软件进行统计分析 结果 原代分离的骨髓为形态不均一的细胞 经传代4次后 细胞形态均一 对传4代以上的细胞行流式细胞仪检测 结果示阳性表达 CD29 CD105 CD44 阴性表达CD34 CD14 CD45 说明培养的细胞表达间充质干细胞的表面标志 而不表达造血干细胞 内皮祖细胞的表面标志 将MSCs加 入含bFGF EGF的DMEM F12 1 1 无血清培养基进行诱导分化 部分细胞5 7天后胞质向胞核收缩 胞体变小 变成多角形和不规则形 14天后可见部分 回缩的胞体延纵轴伸出长长的突起 交织成网状 间接免疫荧光法检测显示 诱导前部分骨髓MSCs表达nestin 基本不表达神经元特异性烯醇酶 neuron specificenolase NSE 神经微丝 neurofilament NF L 和胶质纤维酸性蛋白 glial fibrillary acidic protein GFAP 诱导分化2周时 细胞表 达nestin NSE和NF L显著增加 GFAP在诱导分化2周的细胞中仍基本不表达 免疫印迹法检测得到相似结果 以上结果表明MSCs主要向神经元分化 流 式细胞技术检测发现 诱导前MSCs组表达HLA 类分子的经典基因HLA A B C 不表达HLA 类分子的经典基因HLA DR和共刺激分子 诱导1周时和诱 导2周时HLA A B C HLA DR 和共刺激分子CD80表达增加 各组间 P 0 05 有显著性差异 然而 流式细胞技术和免疫印迹检测显示诱导2周后CD40和 CD86仍无表达 IFN预处理后 MSCs组 Neu1组和INeu2组表达HLA A B C和HLA DR表达明显增加 与未经 IFN预处理的MSCs组 Neu1组和Neu2组 相比 HLA分子的表达差异有显著意义 P 0 05 但是 流式细胞技术和免疫印迹法检测均显示 IFN预处理前后共刺激分子CD40 CD80和CD86表达无 明显改变 各组细胞分别与同种异体T细胞共培养6天后 结果显示MSCs抑制T细胞增殖 并且随着MSCs向神经细胞分化 抑制作用明显增强 各组间有显 著性差异 P 0 05 结论 骨髓MSCs向神经细胞诱导分化后 细胞表达HLA分子和共刺激分子CD80增加 不能表达共刺激分子CD40和CD80 并且抑制T细胞增殖 提示细 胞免疫原性低 有成熟的趋势 二 向神经细胞诱导分化中的骨髓MSCs对同种异体T细胞的免疫调节作用 目的 探讨骨髓MSCs向神经细胞分化后对同种异体T细胞的免疫调节作用及其可能机制 方法 骨髓MSCs原代分离 培养并向神经细胞诱导分化 MSCs向神经诱导分化后的细胞分组同第一部分 体外分离同种异体T细胞 向植物血凝素 phytohemagglutinin PHA 刺激同种异体T细胞增殖的培养体系中 加入MSCs向神经诱导分化后的各组细胞 进行共培养 比较 IFN100U ml预处理 48小时前后各组细胞对PHA刺激同种异体T细胞增殖的作用 采用transwell培养板分隔MSCs向神经诱导分化后的细胞和PHA刺激的同种异体T细胞培养体系 均用 液闪仪检测T细胞增殖 结果 与Con组比较 MSCs组 Neur1组和Neur2组细胞抑制PHA刺激的非特异性淋巴细胞增殖作用 各组间P 0 05 有显著性差异 随着MSCs向神经 细胞分化 体外试验中其抑制由PHA刺激的非特异性淋巴细胞增殖作用增强 IFN预处理后 MSCs组 Neu1组和Neu2组细胞对非特异性淋巴细胞增殖的 抑制作用增强 与未经 IFN预处理的三组细胞分别进行配对t检验 均为P0 05 结论 骨髓MSCs向神经诱导分化后的细胞抑制PHA刺激的T淋巴细胞增生 细胞分泌可溶性细胞因子是MSCs向神经诱导分化后的细胞抑制PHA刺激的 T细胞增生的可能机制 三 缺氧缺血脑损伤模型脑内移植向神经细胞诱导分化的骨髓MSCs的免疫排斥反应 目的 探讨向神经细胞诱导分化的骨髓MSCs移植至HIBD模型脑内后的免疫排斥反应 方法 7日龄新生昆明小鼠 随机分为 正常对照组 Con组 HIBD模型组 HIBD组 未分化MSCs移植组 MSCs组 MSCs诱导分化1周细胞移植组 Yeu1组 MSCs诱导分化2周细胞移植组 Neu2组 每组动物12只 根据Ditelberg 1996 报道方法制作新生小鼠HIBD模型 各移植组小鼠10