高效毛细管电泳法--原理.ppt

高效毛细管电泳技术 电泳 及其电泳技术 在电解质溶液中 位于电场中的带电离子在电场力的作用下 以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象 称之为电泳 由于不同离子所带电荷及性质的不同 迁移速率不同 可实现分离 利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术 高效毛细管电泳 HighPerformanceCapillaryElectrophoresis HPCE 简称毛细管电泳 CapillaryElectrophoresis CE 指以高压电场为驱动力 以毛细管为分离通道 依据样品中各组分之间淌度和 或 分配行为上的差异而实现分离的一种液相分配技术 CE是经典电泳技术和现代微柱分离技术相结合的产物 基本装置 CE的基本装置包括一个高压支流电源 一根毛细管 一个检测器及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶 高效毛细管电泳 高效毛细管电泳相对于经典电泳在技术上采取了两项重要改进 一是采用了0 05mm内径的毛细管 二是采用了高达数千伏的电压 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发 大大减小了温度效应 使电场电压可以很高 电压升高 电场推动力大 又可进一步使柱径变小 柱长增加 界面化学电化学理论 1 扩散双电层理论电动电泳现象 在外加电场作用下 溶胶中固液两相相对运动 或者在外加力作用下 迫使固液两相进行相对移动 又可以产生电势差及两相相对运动 这两种相反的现象均与界面电势差及相对运动有关 固液两相产生的原因 1 固体表面从溶液有选择吸附某种离子而带电2 固体表面上的物质粒子 在溶液发生电离 基本理论 在电解质溶液中 带电粒子在电场作用下 以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移 迁移速度为 试中Vep为离子电泳迁移速度 ep为电泳淌度 E为电场强度 q为离子电荷量 为介质粘度 r为离子半径 q 6 r E Vep ep E 基本理论 CE所用的石英毛细管柱 在pH 3时 石英毛细管壁上的硅醇基 SiOH 在水溶液中发生电离 产生的SiO 负离子使毛细管壁内表面带负电 和溶液接触时相应的缓冲液带正电 形成了双电层 基本理论 在高电压作用下 双电层中的水合阳离子引起流体整体朝负极方向移动 该现象称为电渗流 electro osmoticflow EOF 电渗流速度可表示为 其中Veo为电渗流速度 eo为电渗淌度 为双电层的Zeta电位 为分离介质的介电常数 E Veo eo E 电渗流的特点 1具平面流型其电渗驱动力沿毛细管均匀分布 电渗速度的径向分布几乎是均匀的 它使整个流体像一个 塞子 一样以均匀的速度向前运动 不会直接引起样品组分区带扩散 但在HPLC中 采用的压力驱动方式使柱中流体呈抛物线型 其中心处速度是平均速度的两倍 导致溶质区带本身扩张 引起柱效下降 使其分离效果不如CE 分离原理 粒子在电解质溶液中的迁移速度等于电泳和电渗流两种速度的矢量和 即V Vep Veo ep eo E正离子的运动方向和电渗流一致 故最先流出 中性粒子的电泳速度为0 故其迁移速度相当于电渗流速度 负离子的运动方向和电渗流方向相反 但因电渗流速度一般都大于电泳流速度 故它将在中性粒子之后流出 这样 各种粒子因迁移速度不同而实现了分离 分离原理 毛细管柱 毛细管柱是CE的核心部件 目前多为25 75 m之间 材料为聚四氟乙烯 玻璃和弹性石英 以石英居多 选择细内径毛细管柱有利于最大散热 但比表面积大 会增加溶质的吸附作用 分离模式 毛细管电泳根据分离机理不同 具有多种分离模式 能够提供互不相关而又互相补充的信息 毛细管区带电泳 CZE 毛细管胶束电动色谱 MECC 毛细管凝胶电泳 CGE 毛细管等电聚焦 CIEF 毛细管等速电泳 CITP 毛细管电色谱 CEC 毛细管电泳 毛细管区带电泳 CZE CZE又称毛细管自由电泳 是毛细管电泳中最基本 应用最普遍的一种模式 它在毛细管中仅填充缓冲液 基于溶质组分在电场中的迁移速度不同而分离 前述的基本原理即是CZE的基本原理 毛细管胶束电动色谱 MECC 毛细管胶束电动色谱是电泳技术和色谱技术巧妙结合的分离新技术 也是毛细管电泳中唯一能同时分离中性物质和离子型物质的分离模式 分离原理 MECC是在缓冲液中加入表面活性剂 当其浓度高于临界浓度时形成胶束 在电场力的作用下 毛细管水相可看作流动相 胶束相可看作 准固定相 溶质由其在胶束相和水相中的分配系数不同而在不同时间流出 仪器 特点 与HPLC相比 CE的特点是 1 分析速度快 柱效高 2 几乎不消耗溶剂 样品用量小 3 前处理简单 甚至无需前处理 4 可自由选择被分离物质的类型 使图谱清晰 5 毛细管容易清洗 不容易产生柱污染 当然CE也存在许多不足之处 1 灵敏度和线性范围不如HPLC 2 仅能够实现微量制备 3 定量精密度稍低于HPLC 应用 离子分析 体内药物分析 中药分析 手性拆分 蛋白质 多肽 氨基酸分析 DNA RNA分析 抗生素 维生素 糖类