一组PCR特异鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法.doc

说明书摘要 本发明涉及一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法，属于分子标记技术领域，所述的一组PCR特异性鉴别引物的核苷酸序列分别为CL-F：5CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC3；CL-R：5GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC3。采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法步骤为：1）提取待测样品的基因组DNA；2）以步骤1）中提取的基因组DNA为模板，使用特异性PCR鉴别引物对其进行PCR扩增；3）对步骤2）的扩增产物进行电泳检测，在130bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在130bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。本发明只需要进行PCR，然后取PCR产物进行凝胶电泳，根据电泳条带的大小及有无即可区分滇重楼及其混淆品，具有操作简单、快速的特点，在药材真伪品快速检测方面具有独特的优势。1摘要附图1权利要求书1一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：所述的一组PCR特异性鉴别引物为：CL-F：5CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC3；CL-R：5GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC3。2 根据权利要求1所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：其构建的具体步骤为：1） 提取滇重楼及其混淆品的基因组DNA；2） 以步骤1）提取的基因组DNA为模板，使用通用引物ITS2对其进行PCR扩增；3） 对步骤2）的PCR扩增产物进行测序；4） 使用BioEdit软件对步骤3）的测序结果进行序列分析，校对和对比，找出滇重楼特有的变异位点；5） 利用primer premier 5.0软件设计一组特异性PCR鉴别引物。3 根据权利要求2所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：步骤2）中，PCR反应体系总体积为25L，反应体系包括20mM 10PCR Taq buffer（Mg2+plus）、10mM dNTP、上下游引物各10M、1U DNA Taq 聚合酶、1L DNA模板、ddH2O补足 25L。4 根据权利要求2所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：步骤2）中，PCR反应体系的热循环程序为：94预变性3min，94变性30s，56退火45s，72延伸1min，72延伸10min 35个循环。5一种采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，其特征在于：具体步骤为：1）提取待测样品的基因组DNA；2）以步骤1）中提取的基因组DNA为模板，使用特异性PCR鉴别引物对其进行PCR扩增；3）对步骤2）的扩增产物进行电泳检测，在130bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在130bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。6根据权利要求5所述的一种采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，其特征在于：步骤2）中，特异性PCR反应体系的热循环程序为：94预变性3min，94变性30s，56退火45s，72延伸1min，72延伸10min 35个循环。 2说明书一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法技术领域 本发明属于分子标记技术领域，具体地说，涉及一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法。背景技术重楼属 (Paris L.) 是百合科多年生草本植物,中国植物志英文版中记载重楼属植物全世界约有39 个物种, 主要分布在欧亚大陆的热带至温带地区。该属植物在国内多做药用, 其中滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis (Franch.)Hand.- Mazz.)及华重楼 P. polyphylla var. chinensis(Franch.) Hara. 收载于2005 年版中国药典, 是云南白药等多种中药的重要原料之一。然而重楼植物分类复杂, 由于不同类群的特征性状交叉重叠，各类型界限模糊不清，给重楼药用植物鉴定带来困难。近年来，随着对重楼需求量的增大，野生重楼资源急剧减少，采集野生滇重楼不能满足市场需求,更破坏了生态环境和滇重楼资源，寻找鉴定重楼药材的有效方法迫在眉睫。有关重楼植物鉴定，已有形态学、细胞学 (包括核型和染色体多态性)和RAPD、AFLP 等DNA分子标记方面的研究，这些研究都为重楼属药用植物的鉴定提供了依据。而位点PCR技术直接利用DNA 序列进行物种的鉴定，具有独一无二的可重复性，为药用植物鉴定带来了新的机遇。 目前，运用 DNA 分子标记技术对重楼属植物进行鉴定上，有学者运用过 对滇重楼（P. polyphylla var. yunnanensis）、南重楼（Paris vietnamensis）与华重楼（P. polyphylla var. chinensis）等11个物种，比较几种片段各序列扩增和测序效率、种内和种间变异(朱英杰,陈士林,姚辉,谭睿,宋经元,罗焜,鲁静.重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究J. 药学学报. 2010(03) )。也有学者采用扩增叶绿体psbA-trnH 序列计算种内和种间遗传距离，构建邻接树( neighbor-joining tree) 进行滇重楼及其同属物种的鉴定(刘涛，赵英良，杨莹等.滇重楼的psbA-trnH 条形码分子鉴定研究J.天然产物研究与开发，2015，27:758-762)。 上述技术显示了DNA条形码在滇重楼药材真伪鉴别应用的可能性，本发明利用特异性位点PCR的技术，克服了传统鉴别方法中样品量大，主观性大等问题，将之和南重楼、长柱重楼、大理重楼等进行鉴别的分子标记鉴定技术的报道尚未见到。发明内容为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法，直接从DNA分子水平对物种进行鉴定，更能揭示物种的遗传本质，对滇重楼的准确引种栽培、规范商品市场以及临床应用有着重要的现实意义，且操作简单、鉴别快速。为实现上述目的,本发明是通过如下技术方案实现的： 一组PCR特异性鉴别引物为： CL-F：5CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC3；CL-R：5GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC3。 进一步地，一组PCR特异性鉴别引物的构建步骤为： 1）提取滇重楼及其混淆品的基因组DNA； 2）以步骤1）提取的基因组DNA为模板，使用通用引物ITS2对其进行PCR扩增； 3）对步骤2）的PCR扩增产物进行测序； 4）使用BioEdit软件对步骤3）的测序结果进行序列分析，校对和对比，找出滇重楼特有的变异位点；6） 利用primer premier 5.0软件设计一组特异性PCR鉴别引物（CL-F，CL-R）。进一步地，步骤2）中，PCR反应体系总体积为25L，反应体系包括20mM 10PCR Taq buffer（Mg2+plus）、10mM dNTP、上下游引物各10M、1U DNA Taq 聚合酶、1L DNA模板、ddH2O补足 25L。进一步地，步骤2）中，PCR反应体系的热循环程序为：94预变性3min，94变性30s，56退火45s，72延伸1min，72延伸10min 35个循环。 一种采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，具体步骤为： 1）提取待测样品的基因组DNA； 2）以步骤1）中提取的基因组DNA为模板，使用特异性PCR鉴别引物对其进行PCR扩增； 3）对步骤2）的扩增产物进行电泳检测，在130bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在130bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。进一步地，步骤2）中，特异性PCR反应体系的热循环程序为：94预变性3min，94变性30s，56退火45s，72延伸1min，72延伸10min 35个循环。本发明的有益效果：本发明摒弃了植物表观性状易于变化的干扰，不受环境因素、植物生长期的影响，直接从DNA分子水平对物种进行鉴定，更能揭示物种的遗传本质，打破了依赖植物开花期作为滇重楼及物种鉴定的局限，对滇重楼的准确引种栽培、规范商品市场以及临床应用有着重要的现实意义；本发明只需要进行PCR，然后取PCR产物进行凝胶电泳，根据电泳条带的大小及有无即可区分滇重其混淆品，具有操作简单、快速的特点，在药材真伪品快速检测方面具有独特的优势，非常有利于中药的快速鉴别。附图说明 图1为滇重楼及其混淆品总DNA的电泳检测图谱； 图2为滇重楼及其混淆品通用引物ITS2扩增的电泳检测图谱；图3为滇重楼及其混淆品鉴别引物的电泳检测图谱。 图中，1.滇重楼Paris polyphyllavar. yunnanensis (Franch) Hand. -Mazz ；2.毛重楼Paris aireiLeveille ；3.多叶重楼Paris polyphyllaSmith in Rees ；4.七叶一枝花(长狭叶)Paris polyphyllavar. chinensis (Franch.) Hara ；5.大理重楼Paris daliensisH. Li & V. G. Soukup ；6.南重楼Parisietnamensis(Takhtajan) H. L ；7.长柱重楼Paris forrestii(Takht.) H. Li ；8.七叶一枝花Paris polyphyllavar. chinensis (Franch.) Hara ；9.五指莲重楼Paris axialisH. Li ；10.阴性对照。 具体实施方式引物设计 提取滇重楼及其混淆品的基因组DNA，选择通用引物ITS2对滇重楼和混淆品进行扩增，扩增后样品送至上海生工生物公司测序。滇重楼以及其伪品ITS2片段测序所得结果使用BioEdit软件进行序列分析，校对和对比，找出滇重楼特有的变异位点，发现滇重楼变异位点较多，190bp处滇重楼为A，七叶一枝花-长狭叶为T，而其他混淆品为C，203bp处为C，而其他混淆品均为T，206bp处滇重楼为G，而其他混淆品均为C，275bp处滇重楼为A，而其他混淆品均为C，276bp处滇重楼为G，而其他混淆品均为C，320bp处滇重楼为A，而其他混淆品均为G，331bp处滇重楼为T，而其他混淆品均为C，363bp处滇重楼为T，而其他混淆品均为C，389bp处滇重楼为T，而其他混淆品均为C，391bp处滇重楼为T，而其他混淆品均为C，利用primer premier 5.0软件，选择203bp和331bp处的位点设计1对特异性PCR引物（CL-F,CL-R），其核酸序列分别如下：ITS2F：5ATGCGATACTTGGTGTGAAT3ITS3R：5GACGCTTCTCCAGACTACAAT3CL-F:：5CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC3CL-R：5GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC3。实施例1）材料、试剂与仪器 a.材料 材料如下表1所示，分别为滇重楼、毛重楼、多叶重楼、七叶一枝花-长狭叶、大理重楼、南重楼、长柱重楼、七叶一枝花和五指莲重楼。表1样品来源表中文名称拉丁学名收集地收集时间滇重楼Parispolyphyllavar. yunnanensis (Franch) Hand. -Mazz云南昆明2015毛重楼Paris maireiLeveille云南文山2015多叶重楼Paris polyphyllaSmith in Rees云南昆明2015七叶一枝花（长狭叶）Paris polyphyllavar. chinensis (Franch.) Hara云南文山2015大理重楼Paris daliensisH. Li & V. G. Soukup云南文山2015南重楼Paris vietnamensis(Takhtajan) H. L云南文山2015长柱重楼Paris forrestii(Takht.) H. Li云南昆明2015七叶一枝花Paris polyphyllavar. chinensis (Franch.) Hara云南昆明2015五指莲重楼Paris axialisH. Li云南昆明2015 b.试剂琼脂糖(美国Promega公司)；DL2000(北京鼎国昌盛公司)；2PCR MasterMix(上海生工生物科技有限公司)；核酸染料(北京鼎国昌盛公司)；引物为上海生工生物科技有限公司合成。 c.仪器PCR仪(Bio-RAD T100 Thermal Cycler)；凝胶成像系统(G-BOX F3 英国Syngene)；电泳仪(北京市六一仪器厂，型号DYY-6D)。2)基因组DNA提取：取待鉴定样品1g，采用改良的CTAB法提取各样品基因组DNA，于-20保存。3)特异性PCR扩增： 运用特异性引物扩增，反应采用25L体系，其组分含量为： Taq酶PCR预混液 12.5L CL-F 1.0L CL-R 1.0L DNA模板 20ng(0.5L) ddH2O加至 10L扩增程序： 预变性943min 变性9430s 退火5645s 复性721min 保存4 35个循环扩增产物检测及结果：取5L PCR扩增产物加入含核酸染料的1.5琼脂糖凝胶中，100V稳定电压电泳40min，紫外凝胶成像系统观察。如图3所示，结果显示，滇重楼样品在130bp处产生条带，其余样品未产生条带。本发明摒弃了植物表观性状易于变化的干扰，不受环境因素、植物生长期的影响，直接从DNA分子水平对物种进行鉴定，更能揭示物