CE-SDS与SEC-HPLC比较ppt.ppt

CE SDS 非还原 与SEC HPLC方法比较 报告人 袁梵雨 谢敏 娄昆 陈小龙 CE SDS 非还原法 原理简介 毛细管电泳是以高压直流电场为驱动力 以毛细管为分离通道 毛細管內先填充凝胶 此时凝胶会在毛細管內形成分子筛 样品依分子量的大小在毛細管內移动速度不同而进行分离 能够有效减小组分扩散 所得峰型尖锐 分离效率高 CE SDS 非还原 仪器组成 毛细管电泳系统的基本结构包括进样 填灌 清洗 电流回路 毛细管 温度控制 检测 记录 数据处理等部分 CE SDS 非还原 检测器 CE SDS 非还原 进样方式 1 流体力学进样方式 1 进样端加压 2 出口端抽真空 3 虹吸进样 进样量 毛细管长度的1 2 nL级 非常小 2 电动进样方式毛细管一端插入样品瓶 加电压 3 扩散进样试样通过扩散作用进入分离柱端口处 CE SDS 非还原 工作电压的确定 1 在电泳条件下 改变电压 或电流 测定对应的电流 或电压 2 做电压 电流曲线3 取线性关系中的最大电压 或电流 作为分离电压 或电流 线性以上的电压 焦耳热效应过大 一般不宜选用 但如果分离效率很高 就可以选用 以便加快分离速度 在做CGE时 电场强度应控制在150 400V cm之间 否则容易导致凝胶的破坏 电泳温度的选择 电泳温度的选择 主要是指毛细管外表温度的选择与控制 温度变化不仅影响分离的重现性 而且影响分离效率 温度选择应考虑 热效应控制 重现性控制 分离效率控制盒分离介质对温度的限制等因素 多数情况下 在20 30 之间进行电泳 就能获得良好的分离结果 各试剂的作用 SDS MWSampleBuffer 由于蛋白是两性的 与SDS结合会使蛋白带负电荷 使其在毛细管中往正极方向移动 内参蛋白溶液 指示迁移时间的变化 碘乙酰胺 与游离巯基反应 防止其攻击二硫键导致片段增多 样品处理 在1 5mL离心管中加入SDS MWSampleBuffer50 L 内参蛋白溶液2 L 碘乙酰胺溶液10 L振荡混匀 取供试品溶液 2 5mg L 40 L 振荡混匀 将离心管置于70 水浴加热10min 再次振荡混匀 室温冷却 3000rpm离心60s 取上清液90 L至PCR管中 CE SDS 非还原 2010版中国药典对仪器的一般要求 毛细管 弹性石英毛细管 内径50 m和75 m使用较多 根据分离度要求 可选用20cm 100cm长度 CE SDS 非还原 直流高压电源 采用0 30kV 或相近 可调节直流电源 可供应约300 A电流 具有稳压和稳流两种方式可供选择 冲洗进样系统 每次进样之前毛细管要用不同溶液冲洗 进样方式有压力进样 负压进样 虹吸进样和电动进样 通过控制压力或电压及时间来控制进样量 检测系统 将毛细管接近出口端的外层聚合物剥去2mm一段 使石英壁裸露 毛细管一侧放置一个石英聚光球 使光源聚集在毛细管上 透过毛细管达到光电池 对无光吸收或荧光的溶质的检测 还可采用间接测定法 即在操作缓冲液中加入对光有吸收或荧光的添加剂 在溶质到达检测窗口时出现反方向的峰 对电泳实验的影响因素 缓冲液pH pH能影响样品的解离能力 样品在极性强的介质中离解度增大 电泳速度也随之增大 从而影响分离选择性和分离灵敏度 CE SDS 非还原 分离电压 温度 温度影响分离重现性和分离效率 温度升高 缓冲液粘度降低 分析时间减短 分析效率提高 但温度过高 会引起毛细管柱内径向温差增大 焦耳热效应增强 柱效降低 分离效率也会降低 SEC HPLC 体积排阻色谱 SEC 是利用多孔凝胶固定相的独特特性 而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来分离的液相色谱方法 简介 分离机理 固定相是多孔性凝胶 大分子不能进入凝胶孔洞而完全被排阻 只能沿多孔凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱 首先被洗脱出来 中等大小的分子能进入凝胶中一些适当的孔洞中 但不能进入更小的微孔 在柱中受到滞留 较慢地被洗脱出来 小分子可进入凝胶中绝大部分孔洞 在柱中受到更强的滞留 会更慢地被洗脱出 图示 仪器 高效液相色谱仪需定期检定 周期为1年 SEC HPLC 2010版中国药典对仪器的一般要求和色谱条件 色谱柱 多使用凝胶或亲水刚性 多孔微球 机械强度好的聚合物等填充物使用水或缓冲盐作为流动相 流动相的pH值一般控制在2 8之间 流速一般在0 5 1 0ml min 检测器 常用UV 紫外 可见 检测器 检测波长通常为280nm SEC HPLC 柱效率N 色谱柱的效率可借用 理论塔板数 N进行描述 分离度R 判断物质在色谱柱中的分离情况 常作为柱的总分离效能指标 式中 tR1 tR2分别为对应于峰1和峰2的保留时间 W1 W2分别为峰1和峰2的峰底宽 色谱柱性能评价的两个重要参数 N 16 tR W 2 5 54 tR W1 2 2 tR为保留时间 W代表峰宽 W1 2 半高峰宽 通过峰高的中点作平行于峰底的直线 此直线与峰两侧相交两点之间的距离 R 2 tR2 tR1 W1 W2 SEC HPLC 色谱柱填料的孔径大小及其粒径分布均匀性孔径太小 待测物不易流出 分析时间长 展宽严重 孔径太大则很可能导致组分分不开 在做凝胶色谱时 先大致估计下待分析物的分子量 然后选择合适的柱子 如果不知道粒径 可先用大孔径的先试试 接着再用小粒径的以达到更高的精度 流动相 凝胶色谱中流动相的影响不像别的色谱 如反相or离子色谱 那么明显 其中主要影响的是流动相的流速 一般流速越大 出峰越快 但分离效果可能不是很好 色谱柱高度和直径 色谱柱越长 样品组分分的越开 但过长时会消耗太多的溶剂 而且柱展宽等也容易变的严重 色谱柱直径太大时 样品沿径向的分布容易不均匀 容易出现柱中心处比柱四周跑的快 从而增加了展宽 影响色谱分离因素 两种检测方法的结果评定 抗体结构 IgG HL HH HHL LC HC HMW 11 9 HMW 7 4 HMW 0 9 两种方法例证比较 SEC HPLC 示例图如下 CE SDS DP 40 30天 GB232 20121102DP 40 20天 GB232 20121102DP 40 10天 GB232 20121102DP GB232 20121102 HMW LMW 总结 优势 不足 分子尺寸相同的混合物 如同分异构体的混合物 不易分开 优势与不足 操作简便快捷 数据可靠且